Материал: Методы исследования в медицинской бактериологии
106
Рисунок 99 – СО2-инкубатор. Заимствовано из Интернет-ресурсов.
Анаэробные пакеты представляют собой пластиковые прозрачные герметически закрывающиеся пакеты вместимостью 1-2 чашки Петри. Анаэробные условия в пакете создаются путем химического связывания кислорода. Анаэробные условия также контролируются тест-полоской. Анаэробные пакеты удобны для использования в небольших лабораториях, для транспортировки материалов в лабораторию, в полевых условиях.
5.2.3. Получение чистой культуры бактерий
Классический культуральный (бактериологический) метод остается “золотым стандартом” диагностики большинства инфекционных заболеваний. Он осуществляется в несколько этапов.
1 этап. Посев исследуемого материала на питательные среды.
2 этап. Пересев изолированных колоний на скошенный агар в пробирки для получения чистой культуры бактерий.
3 этап. Идентификация чистой культуры бактерий (определение рода и вида), определение чувствительности чистой культуры к антибиотикам и бактериофагам.
4 этап. Выдача заключения.
Основной недостаток культурального метода – длительность исследования. Например, для быстрорастущих микроорганизмов результат может быть получен через 2-3 суток после посева на плотную питательную среду, а для медленно растущих бактерий и микроскопических грибов – от 5-7 до 21 суток.
Чистой культурой называют популяцию микроорганизмов одного вида, выращенную из изолированной колонии на плотной или в жидкой питательной среде.
Методы получения чистой культуры бактерий:
- методы механического разобщения бактерий;
107
-биологический метод (заражение чувствительных лабораторных животных);
-методы, основанные на избирательной чувствительности бактерий к физическим факторам (высокая и низкая температура) или химическим веществам (кислотам, щелочам, солям, антибиотикам, красителям).
Наиболее часто для получения чистой культуры бактерий используют принцип механического разобщения. При этом исследуемый материал высевают на плотную питательную среду таким образом, чтобы получить изолированные колонии для последующего их пересева на скошенный агар в пробирках.
Методы механического разобщения бактерий:
-посев исследуемого материала на питательный агар в чашки Петри с помощью бактериологической петли, шпателя, пипетки. При таком способе материал, находящийся на петле (шпателе, пипетке), расходуется постепенно и переносится на среду по линиям посева все в меньшем и меньшем количестве;
-посев исследуемого материала путем последовательных разведений в питательной среде;
-посев подвижных бактерий в конденсационную воду на скошенный агар.
В настоящее время исторический интерес представляют методы получения
изолированных колоний, предложенные Пастером и Кохом. Однако эти методы до сих пор описывают в учебной литературе, хотя в практической работе они не используются.
Метод Пастера представляет собой последовательные разведения исследуемого материала в жидкой питательной среде до тех пор, пока в среде не окажется одна микробная клетка, давшая рост.
Метод Коха представляет собой последовательные разведения исследуемого материала в расплавленном агаре с последующим переносом агара с разведенной культурой в чашку Петри (рисунок 100).
Разведения
Исследуемый
материал
1:10 |
1:100 |
1:1000 |
1:10000 |
1:100000 |
Рисунок 100 – Получение изолированных колоний методом Коха.
В настоящее время посев исследуемого материала на питательные среды для получения чистой культуры проводится методом механического разобщения бактерий путем посева исследуемого материала на поверхность плотной питательной среды штрихом или с помощью шпателя Дригальского.
Посев однократным истощающим
108
Чаще проводят посев , для этого различные варианты
штрихомрихомпосевыиспользуя секторам
посева (рисунок 101).
а б Рисунок 101 – Посев однократным истощающим штрихом (а) и посевы по секторам
(б). Заимствовано из Интернет-ресурсов.
Техника посева штрихом представлена на рисунке 102.
Рисунок 102 – Посев бактериологической петлей по поверхности питательного агара в чашке Петри для выделения чистой культуры (Воробьев А.А. и
др., 2006).
Результаты посева штрихом представлены на рисунке 103.
Рисунок 103 - Результаты посева штрихом. Заимствовано из Интернет-ресурсов.
109
При посеве методом Дригальского используют несколько чашек с питательной средой. Исследуемый материал наносят на первую чашку, растирают шпателем круговыми движениями по поверхности агара, а затем этим же шпателем
последовательно наносят та шийся на шпателе материал на другие чашки |
|
(рисунок 104). |
Посев по Дригальскому |
|
|
Рисунок 104 – Посев по Дригальскому: 1 – шпатель; 2 – техника посева; 3 – результат посева. Заимствовано из Интернет-ресурсов.
Всовременных микробиологических диагностических системах используются новые инновационные принципы посева исследуемого материала на плотные питательные среды в чашках Петри: посев по кругу с помощью пластикового аппликатора или посев магнитным крутящимся шариком.
Вчастности, посев по кругу с помощью пластикового аппликатора применяется в системе PREVI Isola (рисунок 105).
Рисунок 105 - Система PREVI Isola. Заимствовано из Интернет-ресурсов.
110
В системе PREVI Isola посев осуществляется с помощью одноразового пластикового аппликатора, автоматически производящего круговое движение по поверхности агара. В результате этого обеспечивается хорошая изоляция колоний (рисунок106).
1 2
Рисунок 106 – Ручной посев штрихом (1) и посев с помощью PREVI Isola (2). Заимствовано из Интернет-ресурсов.
Система PREVI Isola позволяет засевать исследуемый образец одновременно на различные среды, подаваемые в аппарат автоматически по заранее установленной программе (до 10 сред).
Посев магнитным крутящимся шариком используется в высокотехнологичной системе WCA-3 (BD Kiestra). В этой системе металлический шарик с исследуемым материалом на своей поверхности под действием магнитных сил совершает вращение и движение по пластинке агара, покрывая до 95% площади чашки (рисунок 107).
Рисунок 107 – Высокотехнологичная система WCA-3 (BD Kiestra). Заимствовано из Интернет-ресурсов.