Материал: Методы исследования в медицинской бактериологии
91
пептонный бульон, мясопептонный агар. В состав сложных сред дополнительно к простым средам входят соли, сахара, экстракты, микроэлементы, витамины и другие компоненты. К сложным (богатым) питательным средам относятся кровяной агар, асцитический агар, сывороточный агар.
По консистенции выделяют жидкие, полужидкие и плотные среды. Жидкие среды представляют собой настои, отвары, бульоны, приготовленные на основе мяса, рыбы, овощей (естественные среды), а также композиции определенных концентраций химических соединений (искусственные среды). Широко распространенной жидкой питательной средой является мясопептонный бульон (МПБ). Полужидкие среды получают путем добавления к жидким средам 0,5-0,9% агара или желатина (в частности, мясопептонный желатин - МПЖ). К плотным питательным средам относят среды, содержащие 1,5-3% агара, в частности, мясопептонный агар - МПА (рисунок 80).
а |
б |
в |
Рисунок 80 – Питательные |
среды: а – МПБ, б – МПЖ, в – МПА. |
|
Агар – это полисахарид сложного состава из морских водорослей, основной отвердитель для плотных питательных сред.
В качестве универсального источника углерода и азота применяют пептоны (продукты расщепления белков пепсином) или различные гидролизаты (мясной, рыбный, казеиновый, дрожжевой).
По назначению среды подразделяются на основные (универсальные) и специальные. Основные (универсальные) среды пригодны для роста большинства бактерий. К ним относятся мясопептонный агар (МПА) и мясопептонный бульон
(МПБ).
Специальные среды предназначены для культивирования тех бактерий, которые не растут или очень плохо растут на универсальных средах. В частности, среда Китта-Тароцци (мясопептонный печеночный бульон, МППБ) используется для культивирования анаэробов. В ее состав входят: питательный бульон, 0,5% натрия хлорида, кусочки печени или мяса для адсорбции кислорода. На поверхность среды наслаивают тонкий слой вазелинового масла и стерилизуют при 120°С в течение 30 минут. Перед посевом из среды удаляют воздух прогреванием ее на кипящей водяной бане в течение 15 минут.
Для выделения облигатных анаэробных бактерий используют также следующие питательные среды:
- анаэробный кровяной агар с гентамицином;
92
-анаэробный кровяной агар с неомицином и налидиксовой кислотой;
-анаэробный кровяной агар с канамицином и ванкомицином;
-фруктозо-циклосерин-цефокситиновую среду (для Clostridium difficile);
-тиогликолевую полужидкую среду;
-среду Вильсона-Блера (железо-сульфитный агар).
К специальным средам относятся дифференциально-диагностические, селективные, элективные, накопительные (среды обогащения), транспортные и консервирующие питательные среды.
Дифференциально-диагностические среды представляют собой сложные среды, позволяющие выделять чистую культуру бактерий с одновременной их идентификацией по какому-либо биохимическому признаку. Дифференциальнодиагностические среды содержат питательную основу, дифференцирующее вещество (субстрат) и индикатор. Например, дифференциально-диагностические среды позволяют идентифицировать бактерии по следующим признакам:
-гликолитическая (сахаролитическая) активность (разложение углеводов) – среды Гисса (содержат 1 углевод), Эндо, Левина, Плоскирева, Рассела (содержат 2 углевода), Клиглера (содержат 3 углевода) и др.;
-протеолитическая активность (разложение белков) – МПЖ, свернутая сыворотка, молочный агар;
-гемолитическая активность (разрушение эритроцитов) – кровяной агар. Элективные питательные среды содержат вещества, ингибирующие рост
посторонней микрофлоры, но не влияющие на жизнедеятельность искомого вида бактерий. В качестве таких веществ используют анилиновые красители, желчь, натрия хлорид и др.
Селективные питательные среды содержат не только вещества,
подавляющие рост одних микроорганизмов, но и вещества, стимулирующие рост других видов бактерий.
В таблице 11 приведены наиболее часто используемые в микробиологии в составе питательных сред индикаторы.
Таблица 11 – Индикаторы, наиболее часто используемые в микробиологии
Название |
Окраска среды в зависимости от величины рН |
||
индикатора |
щелочная |
нейтральная |
кислая |
Андреде |
бесцветный |
бесцветный |
красный |
Бромтимоловый |
бирюзовый |
зеленый |
желтый |
синий |
|
|
|
ВР (водный |
малиновый |
бесцветный |
синий |
голубой и |
|
|
|
розоловая кислота |
|
|
|
Феноловый |
малиновый |
красный |
желтый |
красный |
|
|
|
Жидкие среды Гисса состоят из пептонной воды, 0,5% углевода (сахара или многоатомного спирта) и 0,5% индикатора Андреде (0,5 г кислого фуксина, 16 мл 4% раствора едкого натра, 100 мл дистиллированной воды). Среды с углеводами
93
разливают в пробирки с “газовками” (поплавками, трубками Дюлхема), опущенными в пробирки вверх дном. Среды Гисса могут быть жидкие и полужидкие (без “газовок”), содержащие 0,25% агара. В жидких средах с реактивом Андреде при ферментации углевода образуется кислота, под действием которой изменяется окраска среды (среда меняет желтый цвет на красный). Образовавшиеся при ферментации углевода газообразные продукты скапливаются в поплавках (рисунок 81).
1 2 3
Рисунок 81 – Среды Гисса с реактивом Андреде: 1 – исходная среда; 2 – ферментация углевода до кислоты; 3 – ферментация углевода до кислоты и газа. Заимствовано из Интернет-ресурсов.
Полужидкие среды Гисса с реактивом ВР (смесь водного голубого и розоловой кислоты) при разложении углевода до кислоты меняют окраску с желтой на синюю, а газообразование проявляется пузырьками в толще среды (рисунок 82).
1 2 3
Рисунок 82 – Среды Гисса с реактивом ВР: 1 – исходная среда; 2 – разложение углевода до кислоты; 3 – разложение углевода до кислоты и газа. Заимствовано из Интернет-ресурсов.
Вариантом сред Гисса в пробирках являются картриджи с питательной средой и индикатором. Внесение исследуемого материала в них осуществляется через центральный капилляр (рисунок 83).
94
Контроль
Рисунок 83 – Картриджи “пестрого ряда”: 1 – глюкоза; 2 – лизин; 3 – орнитин; 4 – индол; 5 – адонит; 6 – лактоза; 7 – арабиноза; 8 – сорбит; 9 – тест ФогесаПроскауэра (образование ацетоина при анаэробном превращении глюкозы); 10 – дульцит; 11 – мочевина; 12 – цитрат натрия.
Среда Левина состоит из МПА, лактозы и индикатора (метиленовый синий, эозин и фосфорнокислый калий). Среда имеет первоначально фиолетовый цвет. На среде Левина лактозоположительные колонии E. coli имеют темно-фиолетовый (черный) цвет с зеленым блеском (рисунок 84).
Рисунок 84 - Лактозоположительные колонии E. coli на среде Левина. Заимствовано из Интернет-ресурсов.
Среда Эндо состоит из МПА, 0,5-1% лактозы и 0,5% насыщенного спиртового раствора основного фуксина, обесцвеченного 10% сернокислым натрием. Среда Эндо предназначена для выделения энтеробактерий и родственных микроорганизмов с одновременной их дифференцировкой по способности утилизировать лактозу. На такой среде лактозопозитивные бактерии (E. coli) образуют темно-красные колонии с металлическим блеском, а лактозонегативные бактерии (шигеллы, сальмонеллы) – колонии серо-белого цвета (рисунок 85).
95
Рисунок 85 – Рост лактозоположительной кишечной палочки на среде Эндо. Заимствовано из Интернет-ресурсов.
Среда Плоскирева предназначена для выделения патогенных энтеробактерий (шигеллы, сальмонеллы) с одновременным подавлением роста кишечной палочки. Элективным фактором этой среды являются соли желчных кислот. Так как рост кишечной палочки подавляется не полностью, для ее выявления в среду добавлена лактоза (дифференцирующее вещество). Лактозонегативные бактерии (шигеллы, сальмонеллы) образуют на этой среде бесцветные колонии, а лактозоположительные бактерии (кишечная палочка) – темно-красные колонии (рисунок 86).
Рисунок 86 – Рост лактозоположительной кишечной палочки и лактозонегативных бактерий на среде Плоскирева. Заимствовано из Интернет-ресурсов.
К дифференциально-диагностическим средам относят также комбинированные полиуглеводные среды (двухсахарная среда Рассела, трехсахарная среда Клиглера, трехсахарный железосодержащий агар Олькеницкого и др.). Например, среда Олькеницкого содержит: 100 мл МПА, 1 г лактозы, 1 г сахарозы, 0,1 г глюкозы, 1 г мочевины, 0,02 г соли Мора, 0,003 г тиосульфата натрия, 0,4 мл фенолового красного (0,4%-го раствора); рН7,2-7,4 (рисунок 87).