Материал: Методы исследования в медицинской бактериологии

86

Рисунок 74 – Фазово-контрастная микроскопия Bacillus cereus. Заимствовано из Интернет-ресурсов.

При темнопольной микроскопии (при использовании метода темного поля) объект освещается сбоку, поэтому исследователем воспринимаются отраженные лучи. При темнопольной микроскопии можно обнаружить частицы, которые при светлопольной микроскопии не видны. При темнопольной микроскопии изучают движение живых неокрашенных бактерий, например, спирохет. Препарат для темнопольной микроскопии готовят методом “раздавленная” или “висячая” капля. Неосвещенное поле зрения остается темным, а бактерии выглядят ярко светящимися (рисунок 75).

Рисунок 75 – Treponema pallidum при исследовании методом темнопольной микроскопии. Заимствовано из Интернет-ресурсов.

При темнопольной микроскопии можно увидеть только контуры объекта, но невозможно изучить их структуру.

Фазово-контрастная и темнопольная микроскопия позволяют провести прижизненное изучение микроорганизмов.

Люминесцентная (флюоресцентная) микроскопия основана на явлении люминесценции (флюоресценции) - способности объекта под влиянием падающего света (сине-фиолетового света или ультрафиолетовых лучей) испускать лучи с большей длиной волны и другого цвета. При люминесцентной микроскопии используют как естественную (первичную, собственную) люминесценцию микробов, так и искусственную (вторичную, наведенную) люминесценцию. Собственная люминесценция наблюдается без предварительного окрашивания изучаемого объекта специальными красителями. Большинство биологических

87

объектов имеют неяркую собственную люминесценцию, поэтому для их изучения используют вторичную люминесценцию. Вторичная люминесценция возникает после окраски препарата специальными люминесцирующими красителями (флюорохромами, люминофорами), которые способны связываться со специфическими структурами бактериальных клеток. Например, акридиновый оранжевый связывается с нуклеопротеидами клетки, аурамин – с воскоподобными веществами. В люминесцентном микроскопе имеется система светофильтров, пропускающих определенные лучи и задерживающих остальные. При люминесцентной микроскопии наблюдаемые объекты выглядят в виде светящихся форм (рисунок 76).

Рисунок 76 – Люминесцентная микроскопия микобактерий туберкулеза (палочки желтого цвета). Заимствовано из Интернет-ресурсов.

Люминесцентная микроскопия используется как метод экспрессдиагностики, она проводится в прямом и непрямом вариантах. Исследование носит ориентировочный характер.

В последние годы широко используется иммунолюминесцентная микроскопия – реакция иммунофлюоресценции (РИФ) с применением специфических иммуноглобулинов, меченых флюорохромами. В качестве метки чаще всего используют флуоросцеина изотиоцианат (ФИТЦ). Комплекс “антитело + ФИТЦ” позволяет выявлять в РИФ очень низкие концентрации микробных клеток (рисунок 77).

Рисунок 77 – Выявление пневмококков с помощью РИФ. Заимствовано из Интернет-ресурсов.

88

Преимуществами люминесцентной микроскопии являются цветное изображение изучаемого объекта, выявление в исследуемом материале микроорганизмов в небольшой концентрации, возможность использования люминесцентной микроскопии в качестве экспресс-метода обнаружения и идентификации конкретных антигенов (возбудителей).

Электронная микроскопия используется в основном в научноисследовательских лабораториях, так как требует наличия дорогостоящего оборудования, специфической подготовки препаратов для исследования и квалифицированного персонала. Оснащение кабинета электронной микроскопии представлено на рисунке 78.

Рисунок 78 – Оснащение кабинета электронной микроскопии. Заимствовано из Интернет-ресурсов.

В электронно-микроскопических исследованиях используют

сканирующей (б) электронной микроскопии.

При просвечивающей (трансмиссионной) микроскопии ультратонкие срезы клеток обрабатывают солями тяжелых металлов (свинца, ртути, хрома, вольфрама), позволяющими сделать изображение контрастным. Для выявления окислительновосстановительных ферментов используют теллурит калия или соли тетразолия. В трансмиссионных (просвечивающих) электронных микроскопах электроны, проходя

89

через образец, частично задерживаются. Прошедшая через образец часть электронной попадает на экран микроскопа и создает изображение. Те участки клетки, которые слабо рассеивают электроны, выглядят на экране светлыми, а те участки, которые сильно рассеивают электроны, выглядят темными.

При сканирующей электронной микроскопии на изучаемые объекты в вакуумной камере напыляют электронно-плотные вещества. В сканирующих электронных микроскопах тонкий пучок электронов сканирует поверхность клетки. Отраженные от поверхности образца электроны собираются и образуют на экране объемное изображение.

Бактериоскопические методы исследования имеют как достоинства, так и недостатки. Основными достоинствами бактериоскопических методов являются простота, доступность, быстрота проведения исследования, экономичность. Основными же недостатками бактериоскопических методов исследования являются низкая чувствительность и низкая специфичность.

90

5.2. Культуральное исследование

Культуральное исследование предусматривает выделение чистой культуры бактерий на питательных средах и ее идентификацию до вида и рода путем изучения морфологических, культуральных, биохимических, генетических, серологических, биологических свойств. Для изучения указанных свойств используют стандартные диагностические схемы, утвержденные Министерством здравоохранения (“Приказ об унификации микробиологических методов исследования №535 от 1985 г.”). Культуральное исследование позволяет установить этиологический диагноз заболевания путем выделения чистой культуры и ее идентификации, определить дополнительные свойства возбудителя (например, чувствительность к антибиотикам), типировать микроорганизмы (определить внутривидовые различия по генетическим и эпидемическим маркерам).

5.2.1. Питательные среды для выделения, культивирования и идентификации бактерий

Культивирование бактерий (накопление микробной биомассы) производится на питательных средах. Облигатные внутриклеточные паразиты (хламидии, риккетсии, вирусы) культивируются исключительно в биологических системах (на культурах клеток, в куриных эмбрионах, в организме чувствительных лабораторных животных).

Культуральное исследование включает в себя посев материала, взятого от больного или с объектов внешней среды, на питательные среды, выделение чистой культуры возбудителя и его идентификацию. Для выращивания бактерий используют различные питательные среды. Питательные среды должны содержать питательные вещества в доступной для усвоения форме, иметь оптимальное значение рН, быть стерильными.

Питательные среды классифицируются на группы.

По происхождению выделяют естественные, полусинтетические и синтетические среды. Естественные питательные среды представляют собой природные органические соединения непостоянного состава, которые включают продукты животного или растительного происхождения: пептоны, кровь, экстракты и отвары мяса, рыбы, круп.

Полусинтетические питательные среды кроме органических и неорганических веществ известного состава содержат продукты природного происхождения (картофельная среда с глюкозой, дрожжевая среда, сахарный бульон).

Синтетические питательные среды состоят из определенных количеств органических и неорганических химических соединений известного состава. Их рецептура всегда постоянная.

По составу выделяют простые и сложные питательные среды. В состав простых питательных сред входят источники азота (пептон, мясной экстракт) и соли. К простым (обычным) питательным средам относятся пептонная вода, мясо-