Материал: Методы исследования в медицинской бактериологии

82

Окрашивание спор по методу Златогорова. Мазок фиксируют над пламенем горелки. Затем на поверхность мазка помещают полоску фильтровальной бумаги, пропитанной основным феноловым фуксином Циля. Бумагу смачивают 3-5 каплями воды. Препарат подогревают в течение 5-7 минут, обесцвечивают 3% водным раствором серной кислоты в течение 5-10 секунд и промывают водой. Дополнительное окрашивание проводят метиленовым голубым в течение 2-3 минут, после чего мазок промывают водой и высушивают. Споры окрашиваются в красный цвет, а вегетативные клетки - в синий.

Окрашивание спор по Пешкову. После фиксации препарата над пламенем горелки мазок окрашивают метиленовым голубым Лёффлера в течение 15-20 секунд, подогревая над пламенем спиртовки. Препарат промывают водой. Дополнительное окрашивание проводят 0,5% водным раствором нейтрального красного в течение 30 секунд. Затем препарат промывают водой и высушивают. При этом методе споры окрашиваются в красный цвет, а вегетативные формы – в синий или фиолетовый цвет (рисунок 70).

Рисунок 70 – Окраска спор по методу Пешкова. Заимствовано из Интернетресурсов.

Окрашивание жгутиков по методу Лайфсона. Для окраски жгутиков используют три основных раствора: основный фуксин в 95% этиловом спирте – 1,2%, таниновая кислота в дистиллированной воде – 3%, хлористый натрий в дистиллированной воде – 1,5%. Краску готовят, смешивая равные части трех основных растворов. На высушенный препарат бактерий с помощью пастеровской пипетки наносят 1 мл краски и окрашивают в течение 5 - 15 минут. Осадок краски на жгутиках делает их толще и окрашивает в красный цвет (рисунок 71).

83

Рисунок 71 – Жгутики Bacillus cereus, окраска по Лайфсону. Заимствовано из Интернет-ресурсов.

Окрашивание жгутиков бактерий по методу Леффлера (щелочным метиленовым синим). Взвесь бактерий вносят в каплю воды (не размазывая ее петлей), нанесенную на предметное стекло, и дают высохнуть. Для обеспечения сохранности жгутиков необходимо чрезвычайно осторожное обращение с мазком во время всех манипуляций. Обрабатывают 15-20 минут при комнатной температуре протравой следующего состава: 1 мл насыщенного спиртового раствора фуксина и смесь из 10 мл 25% водного раствора танина с 5 мл насыщенного водного раствора сернокислого железа (протраву готовят за несколько суток до употребления; перед употреблением ее отфильтровывают). Препарат тщательно промывают водой, высушивают на воздухе. Докрашивают фуксином Циля в течение 3-4 минут при легком подогревании (без образования паров). Затем препарат промывают водой, высушивают над пламенем горелки. Жгутики окрашиваются в красный цвет.

Окрашивание жгутиков по Морозову (серебрение). Предварительно осторожно готовят взвесь культуры бактерий в 1% растворе формалина. Несколько капель полученной взвеси наносят на предметное стекло. Капли высушивают на воздухе, не распределяя их по поверхности стекла. Затем на высушенный препарат наносят ледяную уксусную кислоту с формалином на 1 минуту. Остаток протравы сливают, и препарат промывают водой. После подсыхания на препарат наносят раствор танина с карболовой кислотой и в течение 1 минуты препарат прогревают над пламенем горелки до появления паров. Препарат снова промывают водой. На подсушенный препарат наносят раствор нитрата серебра и выдерживают до появления темно-коричневой окраски. Окрашенный препарат промывают водой, высушивают и микроскопируют. Тела микробных клеток окрашиваются в черный цвет, жгутики приобретают коричневый цвет (рисунок 72).

84

Рисунок 72 – Окраска жгутиков бактерий по Морозову. Заимствовано из Интернетресурсов.

Окрашивание зерен волютина по методу Нейссера. Фиксированный мазок окрашивают уксуснокислой синькой в течение 1 минуты. Затем краску сливают, препарат промывают водой и обрабатывают раствором Люголя в течение 20-30 секунд. Не промывая водой, мазок окрашивают везувином в течение 10-15 секунд. Затем препарат промывают водой, высушивают и исследуют с иммерсионной системой. Тела бактерий окрашиваются в нежный светло-коричневый цвет, зерна волютина - в темно-синий, почти черный цвет (рисунок 73).

Рисунок 73 – Окраска зерен волютина в клетках C. diphtheriae по Нейссеру. Заимствовано из Интернет-ресурсов.

Окрашивание зерен волютина методом Омелянского. Приготовленный мазок фиксируют над пламенем горелки и окрашивают в течение 30 секунд карболовым фуксином Циля. После промывания мазок обесцвечивают 1% раствором серной кислоты в течение 20-30 секунд. Затем мазок вновь промывают водой и дополнительно окрашивают слабым раствором метиленового голубого (1:40) в течение 15-20 секунд. Микроскопическая картина: гранулы волютина красные, цитоплазма синяя.

Окрашивание гликогена проводится путем добавления к капле культуры такого же количества раствора Люголя. При соединении с раствором Люголя гликоген приобретает красно-бурую окраску.

85

Окрашивание зерен гранулезы осуществляется следующим образом. К капле микробной культуры добавляют каплю раствора Люголя и накрывают покровным стеклом. Под иммерсионной системой микроскопа видны микробные клетки и окрашенные в синий цвет зерна гранулезы.

Окрашивание капель жира производят спиртовым раствором Судана III (0,05 г Судана III в 100 мл 96% этилового спирта). Для этого к капле культуры добавляют краситель и тщательно перемешивают. Препарат высушивают и микроскопируют. Капли жира окрашиваются в красный цвет, а цитоплазма бактерий остается неокрашенной.

Более демонстративно окрашивается жир при добавлении к капле культуры 40% раствора формалина. Через 5 минут после этого на препарат наносят каплю метиленового голубого (1:40), а по истечении 10 минут столько же Судана III. Капли жира принимают розовую или оранжевую окраску, цитоплазма клетки - синюю.

Для выявления отдельных структур бактериальной клетки применяют и другие сложные методы окрашивания (таблица 10).

Таблица 10 – Сложные методы окрашивания клеточных структур бактерий

Фазово-контрастная микроскопия (метод фазового контраста)

представляет собой метод микроскопического исследования малоконтрастных неокрашенных объектов, не видимых при обычной световой микроскопии (например, неокрашенных живых бактерий). Для фазово-контрастной микроскопии используют специальное устройство, состоящее из фазового конденсора, фазовых объективов, вспомогательного микроскопа и светофильтров. Получаемое изображение называется фазово-контрастным (рисунок 74).