Материал: Методы исследования в медицинской бактериологии
грамположительных бактерий
Тейхоевые кислоты 76
Пептидогликан
Наружная мембрана
Пептидогликан
Цитоплазматическая Цитоплазма- мембрана тическая
мембрана
Пе про
а б Рисунок 60 – Схема строения оболочек грамположительных (а) и
грамотрицательных (б) бактерий.
В стенке грамположительных микробов содержится большое количество пептидогликана, поры которого при обработке этиловым спиртом сужаются и препятствуют выходу комплекса, образующегося при взаимодействии генцианового фиолетового с компонентами клетки в присутствии йода. Поэтому грамположительные микробы прочно удерживают краситель и бывают окрашены в фиолетовый цвет.
У грамотрицательных микробов не образуется прочного соединения основных красителей, они легко обесцвечиваются этиловым спиртом, и краситель вымывается. Такие клетки дополнительно окрашивают другим красителем – фуксином в красный (розовый) цвет.
Методика окрашивания бактерий по Граму: на фиксированный препарат наносят несколько капель раствора генцианового фиолетового или помещают полоску фильтровальной бумаги, на которую наливают раствор красителя. Краситель выдерживают в течение 1-2 минут, после чего избыток красителя сливают или снимают фильтровальную бумагу. Не промывая препарата, наносят несколько капель раствора Люголя и выдерживают в течение 1-2 минут до почернения препарата. Избыток красителя сливают. На препарат наносят несколько капель этилового спирта (96%) и выдерживают в течение 30 секунд. После этого спирт сливают, препарат промывают водой, избыток воды сливают. На препарат наносят несколько капель раствора фуксина и выдерживают в течение 1-2 минут. Избыток красителя смывают водой. Препарат высушивают фильтровальной бумагой и досушивают на воздухе. После высушивания препарат микроскопируют с иммерсионной системой.
Метод Грама в модификации А.В. Синева предусматривает использование фильтровальной бумаги, пропитанной генциановым фиолетовым, приготовленным по следующему рецепту: генциановый фиолетовый - 1 г, спирт этиловый 96% - 100 мл, глицерин - 5 мл. Фильтровальную бумагу пропитывают красителем, высушивают и нарезают полосками по размеру покровного стекла. При окрашивании на фиксированный мазок помещают полоску фильтровальной бумаги, наносят несколько капель дистиллированной воды и выдерживают в течение 2 минут. После этого бумагу снимают, оставшуюся жидкость сливают, препарат промывают водой. Затем на препарат последовательно наносят раствор Люголя на 2 минуты, этиловый спирт на 20-30 секунд и снова промывают водой. В заключении на препарат на 1-2 минуты наносят раствор фуксина, избыток красителя смывают
77
водой, препарат высушивают при комнатной температуре или фильтровальной бумагой (рисунок 61).
Рисунок 61 – Грамположительные кокки (синие) и грамотрицательные палочки
(розовые) при окраске по Граму. Заимствовано из Интернет-ресурсов. Прибор для автоматической
Для окраски бактерийокраскипо ГрамуповыпускГрамуются специальные приборы PREVI®Color, позволяющие автоматизировать процесс окрашивания (рисунок 62).
Рисунок 62 – Прибор для окраски бактерий по Граму. Заимствовано из Интернетресурсов.
Прибор PREVI®Color позволяет окрашивать до 30 слайдов за 5 минут, причем все слайды окрашиваются стандартно.
Окраска по Граму может быть заменена тестом Грегерсена, не требующим микроскопирования. Тест Грегерсена заключается в следующем: в капле 3% водного раствора едкого калия на предметном стекле эмульгируют бактерийную массу, взятую с плотной питательной среды. После нескольких секунд перемешивания петлей взвесь ослизняется и за петлей тянутся слизистые нити, что указывает на принадлежность испытуемой культуры к грамотрицательному виду бактерий. У грамположительных бактерий слизистые нити не образуются - реакция отрицательная.
Окраска кислотоустойчивых бактерий. Кислотоустойчивыми называют бактерии, которые с трудом воспринимают красящие вещества в результате наличия в клеточной стенке специфических компонентов (липиды, воска). Предложено
78
несколько способов воздействия на клеточную стенку кислотоустойчивых бактерий (карболовой кислотой, высокой температурой). Основным способом окраски кислотоустойчивых бактерий является способ Циля-Нельсена. Именно этим способом пользуются для обнаружения кислотоустойчивых туберкулезных палочек в мокроте больных туберкулезом.
Для окраски по Цилю-Нельсену на фиксированный мазок помещают полоску фильтровальной бумаги и наносят несколько капель карболового фуксина Циля. Можно использовать заранее заготовленную пропитанную фуксином и высушенную фильтровальную бумагу, на которую наносят 2-3 капли воды. Мазок с краской 2-3 раза подогревают на пламени спиртовки до появления паров, каждый раз отставляя препарат в сторону для охлаждения. Бумажку с краской снимают, и остывший препарат промывают водой. Препарат обесцвечивают 5% раствором серной кислоты и тщательно промывают водой. Докрашивают препарат раствором
метиленовой синьки |
|
бактерии по методу |
|
Циля-Нельсена |
Окраска микобактерий по Цилю- |
бактерии - в |
|
Нильсену |
|
||
синий цвет (рисунок |
|
|
|
|
|
|
|
Рисунок 63 – Окрашивание микобактерий туберкулеза (рубиново-красные палочки) методом Циля-Нельсена. Заимствовано из Интернет-ресурсов.
Для окрашивания некоторых бактерий (в частности, спирохет) используют метод Романовского-Гимзы. Краска Романовского-Гимзы – это смесь азура, эозина и метиленовой синьки. Раствор этой краски сине-фиолетового цвета. Она окрашивает цитоплазму клеток в голубой цвет, а ядра клеток, зернистость, слизь, капсулы бактерий - в красно-фиолетовый цвет. Окрашивание по РомановскомуГимзе позволяет обнаружить различные структурные компоненты клеток. Непосредственно перед окрашиванием бактерий к 10 мл дистиллированной воды добавляют 10 капель краски Романовского-Гимзы и тотчас же наливают на фиксированный препарат (или погружают препарат в стаканчик с краской). Через 1 час краску сливают, препарат промывают водой, высушивают на воздухе и микроскопируют (рисунок 64).
79
Рисунок 64 – Микроскопическая картина боррелий, окраска по РомановскомуГимзе. Заимствовано из Интернет-ресурсов.
Для выявления некоторых структурных компонентов бактериальной клетки разработаны специальные методы окраски.
Для выявления капсулы у бактерий применяют метод окрашивания Бурри или Бурри-Гинса. Для окраски по методу Бурри на предметное стекло наносят каплю туши, а рядом с ней - каплю исследуемого материала. Обе капли тщательно перемешивают и с помощью стекла со шлифованным ребром из полученной смеси готовят толстый мазок. После высыхания на мазок наносят иммерсионное масло и микроскопируют с иммерсионной системой. На черном фоне микробные клетки выглядят в виде темных тел, окруженных светлой зоной (рисунок 65).
Рисунок 65 – Окраска капсулы по методу Бурри. Заимствовано из Интернетресурсов.
При окраске капсулы по методу Бурри-Гинса мазок высушивают, фиксируют на пламени спиртовки и окрашивают тушью и фуксином или сафранином в течение 2-3 минут. Краситель сливают, мазок высушивают и микроскопируют с иммерсионной системой. Бактерии окрашиваются в красный цвет, капсулы остаются неокрашенными и четко выделяются на черном фоне (рисунок 66).
80
Рисунок 66 – Окрашивание капсулы методом Бурри-Гинса. Заимствовано из Интернет-ресурсов.
Для выявления капсулы бактерий используют также метод Ольта. При этом мазок окрашивают 2-3% раствором сафранина. Краситель готовят перед употреблением, растворяя его в горячей воде с последующим фильтрованием. Окрашивают при легком нагревании в течение 1-3 минут и быстро промывают водой. Препарат не высушивают, на нем должна быть вода, накрывают покровным стеклом и рассматривают под иммерсионной системой микроскопа. Световые лучи, проходя через слой воды, усиливают разницу в преломлении лучей от капсулы и тела микробной клетки. В поле зрения микроскопа видно, что тела микробных клеток окрашены в красный цвет, капсулы - в желтый (рисунок 67).
Капсула
Бактерия
Рисунок 67 – Окрашивание капсулы по методу Ольта. Заимствовано из Интернетресурсов.
Метод Михина также используется для выявления капсулы бактерий. Фиксированный мазок окрашивают метиленовым голубым Лёффлера в течение 2-3 минут при подогревании. Краситель быстро смывают водой, мазок высушивают. При микроскопировании микробные клетки выглядят темно-синими, капсулы - светло-розовыми (рисунок 68).