Материал: Методы исследования в медицинской бактериологии

66

(органа). Срезом ткани прикасаются к предметному стеклу, оставляя след – отпечаток.

Высушивание мазков. После приготовления препарат высушивают обычно при комнатной температуре на воздухе. Хорошо приготовленный тонкий мазок высыхает равномерно и быстро. Если же высушивание препарата замедлено, то для ускорения высыхания препарат подогревают, держа стекло мазком вверх, в струе теплого воздуха высоко над пламенем горелки. Это нужно производить крайне осторожно, не допуская перегревания мазка, так как при этом может произойти слишком быстрое свертывание белков в цитоплазме микробной клетки, что приводит к нарушению ее структуры. Высушивание можно проводить также в термостате при температуре 36-38°С. Высушивание проводится до появления сплошного белого налета на поверхности предметного стекла.

Фиксирование препарата. Высохший препарат фиксируют – закрепляют на стекле. Цели фиксации препарата: инактивация микробов и обеспечение безопасности дальнейшей работы; плотное прилегание мазка к стеклу; разрушение микробных мембран для лучшего восприятия красителей. Фиксацию проводят с использованием физического или химического способа. Чаще пользуются физическим способом: препарат 2-3 раза проводят над пламенем горелки, не допуская сильного нагревания стекла.

Из фиксирующих химических средств используют эфир, этиловый или метиловый спирт, формалин, смеси формалин-спирт, спирт-эфир, ацетон. Для фиксации высушенный препарат помещают в стаканчик с фиксирующей жидкостью (или 1-2 капли жидкости наносят на препарат) и выдерживают в среднем 3-5 минут. Затем мазок промывают водой и высушивают фильтровальной бумагой.

Иногда препараты фиксируют парами альдегидов или кислот. При фиксировании парами формалина предметные стекла помещают на стеклянные палочки или спички мазком вниз. При слабом подогревании формалина в чашке Петри образуются пары, которыми и фиксируется мазок.

По окончании фиксирования на стекле с обратной стороны мазка восковым цветным карандашом или маркером обводят границу (зону) препарата, чтобы после окраски точно знать место его нахождения.

5.1.3. Микроскопирование микробов в живом состоянии

Препараты живых микробов используют для изучения размеров и формы клеток, способа их размножения, подвижности, процесса спорообразования, структуры колоний и других признаков. Особенность этих препаратов состоит в том, что в них микробы находятся в естественном, неизмененном состоянии. Преимуществом этого метода является то, что наблюдение микробов в живом виде позволяет выявить ряд свойств, не обнаруживаемых у фиксированных микробов, например, их подвижность.

Вместе с тем микроскопирование микробов в живом состоянии имеет ряд недостатков: низкая контрастность живых клеток, трудность исследования неокрашенных микробов ввиду их малой величины, невозможность длительного

67

наблюдения за микробной клеткой в связи с ее быстрым перемещением в поле зрения (как при активной ее подвижности, так и в силу броуновского движения). В связи с этим исследование микробов в живом состоянии дает возможность получить только самое общее представление об их морфологии. Однако исследование в живом состоянии крупных микроорганизмов (грибки, простейшие и др.) позволяет изучить тонкую структуру их клетки лучше, чем в окрашенном препарате. При этом обращение с живыми патогенными микробами требует исключительной осторожности и соблюдения правил техники безопасности (например, обязательное погружение препарата в дезинфицирующий раствор после микроскопирования).

Изучение колоний микробов. Для изучения формы и структуры колоний микробов их выращивают на прозрачных плотных питательных средах, разлитых в чашки Петри, дно которых ровное, гладкое, без царапин и деформаций, создающих искаженные изображения или помехи проходящему свету. Колонии изучают в проходящем свете или при боковом освещении, обращая внимание на форму краев и поверхности, структуру, размер, окраску колоний. Для микроскопии используют в этом случае объектив малого увеличения.

Препарат “отпечаток колонии”. Для изучения состояния клеток микробов в колонии, их взаимного расположения, формы спор и спороносцев мицелиальных грибов готовят препарат “отпечаток колонии”. С этой целью из плотной питательной среды вырезают стерильным скальпелем блок с единичной колонией размером 1x1 см. Блок извлекают и переносят на предметное стекло колонией кверху. К колонии прикладывают второе обезжиренное сухое предметное стекло так, чтобы отпечаток колонии пришелся на его середину, слегка прижимая к колонии. Затем верхнее стекло с отпечатком колонии переворачивают отпечатком кверху, на отпечаток наносят каплю воды, перемешивают. Полученную суспензию накрывают покровным стеклом, и препарат микроскопируют.

Чаще всего для исследования микробов в живом состоянии готовят препараты “раздавленной капли” или “висячей капли”. В некоторых случаях применяют прижизненную (витальную) окраску микробов. Раздавленную или висячую каплю микроскопируют с помощью сухих систем или с иммерсионной системой в затемненном поле зрения - при суженной диафрагме и опущенном конденсоре. Лучше всего их микроскопировать в микроскопе с темным полем зрения.

Препарат “раздавленная капля” готовится следующим образом. На середину сухого чистого предметного стекла с соблюдением правил асептики наносят бактериологической петлей или пастеровской пипеткой каплю дистиллированной воды или физиологического раствора. В эту каплю бактериологической петлей вносят микробную массу из колонии и тщательно перемешивают, получая взвесь бактерий. Жидкую культуру наносят на стекло пастеровской пипеткой. Каплю осторожно накрывают чистым покровным стеклом так, чтобы в суспензии не образовались пузырьки воздуха. Для этого краем покровного стекла прикасаются к поверхности предметного стекла рядом с каплей, наклоняют покровное стекло над каплей и опускают его. Иногда покровное стекло слегка прижимают к предметному стеклу, чтобы выдавить пузырьки воздуха из препарата (рисунок 57).

68

Рисунок 57– Приготовление препарата “раздавленная капля”.

Правильно приготовленная раздавленная капля заполняет все пространство между покровным и предметным стеклом, но при этом жидкость не выступает за края покровного стекла. Препарат микроскопируют. С таким препаратом можно работать в течение 2-4 часов до появления признаков подсыхания. После микроскопии препарат помещают в дезраствор. Иногда этот препарат называют препаратом “придавленная капля”. Если требуется рассматривать препарат продолжительное время, то края покровного стекла предварительно смазывают вазелином.

Препарат “висячая капля”. Для более длительного (в течение 1-2 суток) изучения живых микробов готовят препарат “висячая капля”, в котором предотвращают высыхание препарата посредством помещения капли в герметичную камеру (рисунок 58). В этих условиях изучают размножение, спорогенез и другие свойства живых микробов.

Рисунок 58 – Процесс приготовления препарата “висячая” капля.

На середину стерильного обезжиренного покровного стекла наносят каплю жидкой культуры микроба. Края лунки чистого стерильного предметного стекла с лункой смазывают вазелином. Предметное стекло переворачивают лункой вниз, слегка прижимают его к покровному стеклу с каплей так, чтобы капля оказалась в центре лунки, а лунка герметично закрылась покровным стеклом. После этого предметное стекло вместе с покровным переворачивают. В этом случае капля должна свободно свисать в лунку предметного стекла, не соприкасаясь с ее дном и краями.

Препарат рассматривают в слегка затемненном поле (диафрагму сужают), что увеличивает контрастность неокрашенных форм. При необходимости препарат помещают в термостат для роста культуры и последующего изучения. После микроскопирования препарат помещают в дезраствор.

69

5.1.4. Микроскопирование микробов в окрашенном состоянии

Микроскопический метод в диагностике инфекционных болезней носит ориентировочный характер, так как позволяет выявлять наличие микробов в препарате, определять форму, размеры, взаимное расположение клеток и их структуру (морфологические свойства) а также способность бактерий окрашиваться определенными красителями, то есть способность воспринимать красители (тинкториальные свойства). Ценность бактериоскопического метода состоит в простоте выполнения методик, доступности материалов, в быстроте получения результатов. Однако специфичность микроскопического метода мала, так как многие микроорганизмы по морфологии близки друг другу. Чувствительность этого метода также ограничена, так как концентрация микробных клеток в 1 мл материала должна составлять в среднем 10·105 клеток и более.

Для бактериоскопического исследования используют световую, фазовоконтрастную, темнопольную, флюоресцентную (люминесцентную) и электронную микроскопию в зависимости от вида возбудителя. При световой микроскопии требуется окрашивание исследуемого материала. С этой целью применяют как простые (щелочной синькой, фуксином), так и сложные методы окраски (по Граму, Цилю-Нельсену, Бурри-Гинсу, Лёффлеру и др.).

Для повышения контрастности изображения микробных клеток и изучения их субклеточных структур микроорганизмы окрашивают различными красителями органической природы. Изучение морфологии микробов в окрашенном состоянии является наиболее распространенным в микробиологии методом. Он позволяет изучить морфологические особенности микробов и дает возможность найти различия между ними, иногда даже точно определить изучаемый микроорганизм. Этот метод удобен в практической работе, так как значительно легче производить исследование, пользуясь убитыми микробами, чем живыми (особенно при изучении патогенных микроорганизмов). Он весьма доступен благодаря сравнительной простоте техники окрашивания.

Окрашивание микробов не является механическим процессом проникновения краски в микробную клетку. Механизм окраски микробов следует рассматривать как физико-химический процесс (адсорбцию краски микробной клеткой). В ряде случаев различные составные части микробной клетки избирательно окрашиваются различными красителями.

Фиксированные и окрашенные препараты неживых микробов не опасны, сохраняются без изменений в течение нескольких недель.

Этапы приготовления препаратов окрашенных микробов:

1.Подготовка предметного стекла: мытье, обезжиривание, высушивание и фламбирование. На подготовленном стекле делают необходимые надписи.

2.Приготовление мазка микробов на предметном стекле. При приготовлении препарата каплю суспензии микробов тщательно и равномерно распределяют по поверхности предметного стекла петлей, создавая пленку в виде квадрата площадью 1x1 или 1,5х1,5 см. Распределение суспензии по стеклу проводят до подсыхания жидкости, появления белых пятен по краям пленки. После этого бактериологическую петлю фламбируют и ставят в штатив.

70

3.Высушивание мазка. Влажный мазок высушивают при комнатной температуре, в струе теплого воздуха высоко над пламенем спиртовки или в термостате при температуре 36-38°С до появления сплошного белого налета на поверхности предметного стекла. Нагревать мазок на пламени горелки для его высыхания нельзя, так как при этом происходит деструкция микробных клеток.

4.Фиксирование микробов в мазке. Фиксирование препаратов проводят физическим или химическим способом. При использовании химического способа высушенный препарат помещают в стаканчик с фиксирующей жидкостью или 1-2 капли фиксирующей жидкости наносят на препарат. Экспозиция - 3-5 минут. В качестве фиксирующих химических средств чаще всего используют эфир, этиловый или метиловый спирт, смесь спирта с эфиром в соотношении 1:1 (смесь Никифорова).

Физический способ фиксации заключается в том, что высушенный препарат медленно проводят 2-3 раза через верхнюю часть пламени горелки. Затем препарат остужают на воздухе (рисунок 59).

Рисунок 59 – Физический способ фиксирования препарата.

5. Окрашивание микробов в препарате. Если мазок тонкий и трудно определить, на какой стороне стекла он находится, достаточно слегка поцарапать мазок петлей: должен остаться след на месте мазка. Препараты для микроскопирования окрашивают органическими красителями. После окрашивания избыток красителя удаляется промыванием струей воды.

Для окрашивания микробов применяются анилиновые краски, поступающие в продажу в виде сухих порошков, концентрированных растворов или рабочих растворов. В лабораториях из сухих порошков сначала готовят насыщенные спиртовые растворы красителей, сохраняющиеся в течение длительного времени, но сами по себе не пригодные для окраски бактерий. Поэтому из насыщенных растворов готовят разведенные (рабочие) растворы, которые применяют в повседневной практике.

Количество красителя при окрашивании препарата должно быть таким, чтобы покрывать всю поверхность мазка; излишек краски затрудняет его последующее микроскопирование. Обычно достаточно несколько капель краски, наливаемых при