Материал: m34250_2

Работа 17. Определение количества уксусной кислоты, адсорбированной животным углем

В колбочку отмерить из бюретки точно 20 мл 0,1н раст­вора СН₃СООН. Добавить 10 капель 0,5% раствора фенол­фталеина и оттитровать 0,1н раствором NaOH до появления розовой окраски, не исчезающей в течение 1-2 мин. Рас­ход раствора.NaOH записать.

Во 2-ю колбочку налить точно 25 мл 0,1н раствора СН₃СООН, внести 0,5 г животного угля и встряхнуть в те­чение 3 мин. После раствор отфильтровать через бумажный фильтр. Отмерить пипеткой точно 20 мл фильтрата, приба­вить к нему 10 капель раствора фенолфталеина и оттитро­вать 0,1н раствором NaOH до появления розовой окраски. Расход раствора NaOH записать.

Задание: 1. Выполнить опыт.

2. По разности NaOH, пошедшей на титрование 20 мл СН₃СООН до и после смешивания ее с углем, установить ко­личество СН₃СООН, адсорбировавшейся на животном угле.

Вопросы для самоподготовки по теме 4

1. Адсорбция и абсорбция (понятие, сущность).

2. Адсорбтив, адсорбент, элюция (понятия).

3. Виды адсорбции.

4. Количественное определение адсорбции.

5. Биологическое и практическое значение адсорбции.

Тема 5. Химия и обмен белков

Белки - макромолекулы, состоящие из одной или нескольких полипептидных цепей. Каждая полипептидная цепь построена из большого числа аминокислотных остатков, соединенных в цепи ковалентной пептидной связью.

Линейная полипептидная цепь имеет следующую структуру:

- CO-CH-NH-CO-CH-NH-CO-CH-NH-

R₁ R₂ R₃

По химической структуре белки делятся на простые (протеины, состоят только из -аминокислот, например, коллаген, эластин и др.) и сложные (протеиды, состоят из -аминокислот и других компонентов, например, хромопротеиды, нуклеопротеиды, многие ферменты и др.). В состав белков входит до 22 аминокислот.

По биологической ценности белки бывают: полноценные (содержат полный набор незаменимых аминокислот) и не­полноценные (в них отсутствует одна или несколько незаменимых аминокислот).

По происхождению они могут быть животными, расти­тельными, микробными и искусственными (получены путем органического синтеза), в организме животных - мышеч­ными (актомиозин и др.), кровяными (гемоглобин, глобулины и др.), молочными (казеиноген и др.), печеночными (гемокупреин и др.) и т. д.

Белки обладают амфотерностью, имеют различную М. м. (от 6000 и более), им присущи все свойства гидрофильных коллоидов (оптические, кинетические, электрические).

Работа 18. Определение количества белка в гомогенате мышечной ткани, яйце рефрактометрическим методом

В норме у здоровых животных и человека в сыворотке крови содер­жится 60 — 80 г/л (6—8%) белка. Это состояние называется нормопротеинемия.

При гиперпротеинемии количество белка в сыворотке больше 80 г/л, а при гипопротеинемии - меньше 60 г/л.

Отклонения от нормы в содержании белка в сыворотке крови (гипер- и гипопротеинемия) могут быть по алиментар­ной причине (alimentum - пища), связанной с избытком или недостатком его в рационе, несбалансированностью по­следнего по аминокислотам, особенно незаменимым, а также вследствие нарушений обмена веществ или болезней (ин­фекционные, инвазионные, кровопаразитарные).

Для определения количества белка в биоматериале ис­пользуются различные рефрактометры: РЛ-2, ИРФ-22 и др.

Сущность метода заключается в нахождении показателя светопреломления растворов и пересчете его через формулу в количество белка в них.

Ход опыта

Вначале при работе с рефрактометрами производят настрой по дистиллированной воде. Для этого на нижнюю призму рабочего столика рефрактометров РЛ-2, ИРФ-22/и АМ-2 наносят 1 каплю дистиллированной воды и опускают верхнюю призму столика. Вращая винт окуляра вправо или влево у ИРФ-22 и вдвигая и выдвигая окуляр по направля­ющей у РЛ-2 и АМ-2, наводят резкость на шкалу. Затем, вращая нижний винт у АМ-2, перемещая вверх - - вниз ры­чаг справа у РЛ-2 и вращая винт слева у ИРФ-22 (рядом с зеркальцем - осветителем шкалы, которое надо открыть!), вводят в поле зрения две тени: у РЛ-2 и АМ-2 - темнова­тую вверху и светло-серую внизу; у ИРФ-22 они располага­ются наоборот. При наличии на границе между тенями раду­ги ее удаляют с помощью компенсатора. Затем, смотря в оку­ляр, у ИРФ-22 винтом слева устанавливают границу между тенями строго в поле зрения на перекрест, а у РЛ-2 и АМ-2 устанавливают соответственно рычажком справа и винтом снизу три черточки строго на границу между тенями и сни­мают показатель преломления (Д). Для дистиллированной воды при + 20°С он равен 1,3320.

Аналогичным образом поступают при определении пока­зателя преломления белка и желтка яйца, гомогената мышечной ткани.

После каждого анализа призмы столика вытирают насу­хо мягкой салфеткой.

В исследованиях (особенно научных) обязательно учитывают поправки для показателя преломления на темпера­туру, если она в рабочем столике отклоняется от + 20°С.

Расчет количества белка производят по формуле

,

где С — количество белка (г/л);

Д — показатель преломления биоматериала;

0,00172 — величина, на которую увеличивается показатель преломления при повышении содержания белка в биоматериале на 1%;

10 — коэффициент пересчета белка в г на 1 л биоматериала.

Задание: 1. Освоить методику работы по определению показателя преломления воды на предоставленных рефрактометрах.

2. Найти показатель преломления белка и желтка яйца, вытяжки из мяса.

3. Рассчитать содержание белка в исследуемом материале и в случае отклонения от нормы сделать вывод о причинах явления и мерах, которые следует предпринять, чтобы привести этот показатель в норму.

Работа 19. Определение белка по методу Лоури

Метод основан на измерении интенсивности окраски белков, с помощью фотоэлектроколориметра или спектрофотометра. Метод очень чувствительный, так как позволяет определять от одного до нескольких мкг белка в пробе. При этом белки образуют окрашенные комплексы при одновременном протекании биуретовой реакции и реакции восстановления белками реактива Фолина (смесь фосфорно-вольфрамовой и фосфорно - молибденовой кислот образует с белками комплексное соединение синего цвета).

Для определения готовят следующие реактивы: А — 2% раствор углекислого натрия в 0,1 Н растворе NaOH; Б - 0,5% раствор сульфата меди в 1 % растворе лимоннокислого на­трия; перед употреблением смешивают реактивы Б и А в соотношении 1:50 и получают реактив В;

Фолина - Чокальтеу - в 700 мл дистиллированной во­ды растворить 100 г вольфрамата натрия и 25 г молибдата натрия. Затем прилить 50 мл 85% раствора ортофосфорной кислоты и 100 мл концентрированной НСl. Смесь осторож­но кипятить с обратным холодильником 10 - 12 ч. Потом до­бавить в нее 150 г сульфата лития, 50 мл воды и 5 - 6 ка­пель брома. Снова прокипятить 10 - 15 мин без обратного холодильника для удаления избытка брома. После охлажде­ния довести объем раствора до 1 000 мл. Он должен быть прозрачным (в противном случае его отфильтровать через стеклянную вату), ярко-желтого цвета. Раствор Фолина от­титровать 0,1н раствором NaOH по фенолфталеину и на основании результатов титрования развести водой до 1 Н кон­центрации. Хранить в темной посуде.

Ход опыта

К 0,1 мл гомогената мышечной ткани прилить 9 мл реактива В, пере­мешать и оставить стоять на 10 мин при комнатной темпера­туре. Потом к смеси прилить 0,9 мл реактива Фолина - Чо­кальтеу, перемешать. Через 30 мин провести фотоколоримет­рию (или спектрофотометрию) при длине волны 750 нм, сравнивая исследуемый раствор с контролем, в который вме­сто гомогената взять 0,1 мл дистиллированной воды, при­лить все остальные реактивы. На ФЭКе или СФ найти опти­ческую плотность исследуемого раствора.

Расчет содержания белка произвести по калибровочному графику, который надо построить заранее, используя стан­дартный раствор бычьего альбумина. На оси абсцисс ука­зывают содержание белка в пробе (мкг), на оси ординат - оптическую плотность (Д) исследуемого раствора.

Задание: 1. Выполнить опыт.

2. Определить содержание белка в гомогенате мышечной ткани и сравнить его с нормой для этого животного. В случае откло­нения от нормы указать предполагаемые причины, послед­ствия и пути их устранения.

Работа 20. Разделение смеси аминокислот методом распределительной хроматографии на бумаге

Метод основан на различии адсорбционных свойств и растворимости аминокислот в системе органический растворитель/вода при их продвижении по хроматографической бумаге.

Метод применяют для качественного и количественного определения аминокислот в белках тканей, органов, кормах и свободных аминокислот в биологических жидкостях.

Распределительная хроматография может быть нисходящая, восходящая и круговая.

При восходящей хроматографии полоска бумаги, с нанесенной на нее каплей раствора аминокислот, погружается в ванночку с растворителем, находящуюся на дне камеры (рис.5). Растворитель при этом движется снизу вверх, увлекая с собой аминокислоты. Они движутся по бумаге с различной скоростью, зависящей от их физико-химических свойств.

При достижении фронта растворителя линии финиша, бумажку вынимают из хроматографической камеры, просушивают и опрыскивают раствором нингидрина, с которым аминокислоты образуют комплексы, окрашенные в лиловый цвет.

Ход работы

Взять полоску хроматографической бумаги размером 110 см. Расположить ее на чистом листе обыкновенной бумаги и, отступя 1 см от нижнего края полоски, провести простым карандашом линию старта. Обозначить в ее сере­дине диаметром 1 мм кружок, куда нанести микропипеткой 0,05-0,01 мл приготовленной смеси аминокислот. Пятно подсушить на воздухе. Затем полоску за противоположный край подвесить на крючок пробки хроматографической камеры, подтянуть за проволочку к пробке, с которой опустить в камеру до соприкосновения с растворителем (3), но чтобы линия старта была выше его. Если бумажка не достает до поверхности растворителя, то ее опустить, нада­вливая на проволоку в пробке, которой надо плотно закрыть камеру. Последнюю поставить в термостат при 35 - 40°С, находящийся под вытяжным шкафом. При достижении фрон­та растворителя линии финиша бумажку вынуть (каме­ру опять закрыть плотно пробкой) подвесить на крючок и подсушить при 105°С в сушильном шкафу. После этого хроматограмму взять за верхний край и смочить, протягивая в 0,1% спиртовом растворе нингидрина, налитом в чашку Пет­ри или часовое стекло, и снова подвесить на крючке в су­шильный шкаф. При реакции с нингидрином проявляющиеся пятна аминокислот приобретают лиловую окраску. Опытную хроматограмму сопоставить со стандарт­ной, на которой нанесены известные аминокислоты. Одно­именные аминокислоты на этих хроматограммах располага­ются на равном расстоянии от линии старта и финиша.

Задание: 1. Выполнить опыт.

2. Зарисовать хроматографическую камеру (рис. 2).

3. Определить, какие аминокислоты находятся в исследу­емом растворе. Написать их структурные формулы и указать биороль.

4. Объяснить принцип и технологию хроматографического метода разделения аминокислот.

Работа 21. Определение количества аминокислот в биоматериале по азоту аминогрупп методом формольного титрования по Серенсену

Моноамино-монокарбоновые аминокислоты, содержащие одновременно основную аминную и кислую карбоксильную группы, в водных растворах показывают нейтральную реак­цию. На основании этого считают, что в аминокислотах ами­ногруппа и карбоксильная группа нейтрализуют друг друга.

Таким образом, аминокислоты в водных растворах облада­ют характером внутримолекулярных солей, и, следовательно, непосредственно титровать карбоксильные группы аминокислот щелочью невозможно.

При взаимодействии аминокислот с формальдегидом ами­ногруппа реагирует с последним и образуются производные аминокислот; при этом аминогруппы теряют свои основные свойства:

NH₂ N = CH₂

R — СН + СНОН  R — СН + H₂O

СООН COOH

метиленаминокислота

Карбоксильные же группы в метиленаминокислотах сохраня­ются без изменения и в этом случае могут быть оттитрованы щелочью: N = CH₂ N = CH₂

R — СН + NaOH  R — СН + H₂O

COOH COONa

Количество титруемых при этом карбоксильных групп эквивалентно количеству связанных формальдегидом аминных групп. Таким образом, результат титрования указывает на содержа­ние аминных групп.

Метод основан на блокировании аминогруппы (-NH₂) аминокислоты формальдегидом и оттитровывании оставшей­ся свободной карбоксильной группы (-СООН) щелочью. По расходу последней определяют количество азота NH₂-группы, а по нему рассчитывают содержание аминокислоты в растворе или белке. Этим методом можно определить только содержание нейтральных аминокислот.

Ход опыта

Налить в колбочку 10 мл формольной смеси (состоит из 30 - 40% раствора формалина и нескольких капель 0,1% раствора фенолфталеина) и оттитровать ее (в ней могут быть кислотные примеси) 0,1н раствором NaOH до слабо-розовой окраски, не учитывая количество щелочи.

Затем в эту же колбочку влить 10 мл исследуемой вытяжки из мяса (животных или рыбы) и оттитровать ее содержимое 0,1н раствором NaOH до ярко-красного цвета. Отметить расход 0,1н раствора NaOH на титрование и произвести вычисление.

Расчет. Во-первых, надо найти количество мг азота NH₂-групп в 10 мл исследуемой вытяжки аминокислоты. Для этого количество мл 0,1н раствора NaOH, пошедшего на титрование раствора аминокислоты (например, 5 мл), следует умножить на 1,4 мг (это количество мг азота, соответствующее 1 мл 0,1н раствора NaOH).

5  1,4 = 7 мг азота аминогрупп в 10 мл исследуемого раствора аминокислоты.

Зная М. м. исследуемой аминокислоты, можно по найденному количеству азота ее NH₂-групп определить содержание аминокислоты. Например, определяемая аминокислота глицин (NН₂СН₂СООН). Его М. м. равна 75 мг/моль, а количество азота в нем 14 мг. Следовательно, 14 мг азота образуют 75 мг глицина, а 7 мг азота (вычислено выше) образуют Х мг глицина. Отсюда,

мг глицина в 10 мл вытяжки из мяса.

Задание: 1. Выполнить опыт.

2. Определить количество мг азота NH₂-групп аминокислоты в 10 мл вытяжки из мяса.