Дипломная (вкр): Изучение сезонного биоритма бациллярно-кокковой трансформации бактерии Helicobacter pylori

В качестве первичных антител использовались поликлональные кроличьи антитела против термостабильных антигенов клеточной стенки H.pylori. Они дают четкую окраску бактериальной клетки, в отличие от моноклональных антител, при использовании которых не удалось добиться необходимой четкости. Возможно, это связано с неравномерным распределением специфического антигена на поверхности клетки.

После проведенной иммуноцитохимической реакции в цитологических мазках бактериальные клетки H.pylori (спиралевидные и кокковые формы) окрашивались диаминобензидиномм в цвета от темно-коричневого до насыщенного черного.

3.1.1 Полуколичественная оценка степени обсемененности СОЖ кокковыми формами

Полуколичественная оценка результатов иммуноцитохимических исследований мазков-отпечатков гастробиоптатов осуществлялась на основании предварительно разработанной системы, включающей четыре условные градации:

"0" Кокковые формы H.pylori не выявлены (кокковые формы не встречаются ни в одном из просмотренных полей зрения).

"1" Встречаются единичные кокковые формы (соответствует наблюдению, когда бактериальная клетка-кокк обнаруживается не реже, чем в одном из пяти полей зрения).

"2" Присутствуют кокковые H.pylori (если в каждом просмотренном поле зрения встречаются кокки H.pylori и количество их не превышает 10% от всех наблюдаемых форм H.pylori (спиралевидных и кокковых).

"3" Кокковые формы H.pylori обнаруживаются в значительном количестве, (кокки обнаруживаются практически во всех полях зрения и доля их превышает 10% от всех форм H.pylori (спиралевидных и кокковых)).

Детального представления в количественной шкале по степени обсемененности СОЖ кокками до настоящего времени не существует. Для того, чтобы иметь полное представление о численности (% содержании) кокковых форм в СОЖ необходимо определить процент встречаемости кокковых форм в больших группах пациентов. А так же определить характер распределения пациентов по показателю "процент встречаемости кокковых форм в СОЖ". Для практического использования полуколичественной шкалы необходимо сопоставления одних и тех же пациентов, которые были одновременно оценены по полуколичественной шкале и по количественной шкале, которая подразумевает распределение пациентов по признаку "частота встречаемости кокковых форм в СОЖ".

Проведение такого исследования с выяснением характера распределения пациентов по признаку ""частота встречаемости кокковых форм в СОЖ" крайне необходимо для окончательного выяснения вопроса о том, в каком количестве резерв кокковых форм H.pylori присутствует в антральном отделе желудка.

3.2 Методы исследования и обработки экспериментальных данных.

.2.1 Обработка данных эндоскопических исследований и ИЦХ.

Данные журналов клинических исследований отделения эндоскопии, методом мануального перелистывания с использованием системы естественного визуального контроля и портативной компьютерной техники, были сведены в таблицы Microsoft Exel 2010. Для установления сезонного биоритма нет необходимости учитывать пол и возраст пациента, так как корреляции между этими параметрами и свойствами H.pylori в пищевом тракте не отмечено [54]. Поэтому при составлении базы данных учитывались только данные эндоскопического и иммуноцитохимического исследования и дата проведения обследования. Эндоскопические диагнозы были разбиты на 4 группы в зависимости от степени воспаления СОЖ:

1.      Хронические состояния: хронический гастрит, хронический диффузный гастрит, поверхностный диффузный гастрит, хронический антральный гастрит, очаговый гастрит, поверхностный гастрит, хронический дуоденит, хронический бульбит, культи желудка, полипы желудка и пищевода, хронический атрофический диффузный гастрит, зарубцевавшаяся язва, рубцевая деформация ЛДПК,

2.      Уже не хронические, но еще и не эрозивные: катаральный бульбит, очаговый бульбит, поверхностный бульбит, рефлюкс-эзофагит, катаральный эзофагит, острый эзофагит, пищевод Баррета, ГЭРБ, хронический рефлюкс-гастрит, хронические эрозии.

3.      Эрозивные состояния: эрозии желудка, эрозивный бульбит, эрозивный гастрит, эрозивный дуоденит, эрозивный эзофагит, эрозии 12-перстной кишки, острые эрозии желдка, острые эрозии 12-перстной кишки.

4.      Язвенные состояния: язва желудка, язва 12-перстной кишки, язва ЛДПК, язва пилорического канала, язвы пищевода, острые язвы, рубцующиеся язвы.

В случае наличия нескольких эндоскопических диагнозов, группу выбирали по диагнозу, соответствующему большей степени воспаления (например, диагноз "эрозивный антральный гастрит, острые язвы антрального отдела" относится к 4 группе).

Впоследствии было введено понятие "кокковый индекс" - отношение числа пациентов, у которых было обнаружено значительное количество кокковых форм в СОЖ (по системе это "2" или "3"), к общему числу инфицированных H.pylori.

Графики и диаграммы сезонного изменения степени обсемененности СОЖ кокковыми формами H.pylori строились по данным исключительно 1 группы диагнозов. Это объясняется необходимостью рассмотреть динамику бациллярно-кокковой трансформации в условиях, максимально приближенных к естественным условиям жизни популяции, т.е. как минимум неотягощённых стрессом, связанным с иммунным ответом больного, сопряженного с высокой степенью воспаления в слизистой.

3.2.2 Методы статистической обработки

Достоверность различий данных определялась с помощью критерия Фишера (угловое преобразование Фишера). Этот критерий оценивает достоверность различий между процентными долями двух выборок, в которых зарегистрирован интересующий нас эффект. Суть углового преобразования Фишера состоит в переводе процентных долей в величины центрального угла, который измеряется в радианах. Большей процентной доле будет соответствовать больший угол φ, а меньшей доле - меньший угол, но соотношения здесь не линейные:

где P - процентная доля, выраженная в долях единицы, Где p и q - процентные доли выборок, в которых зарегестрирован интересующий эффект, М и N - объемы выборок [57]

При увеличении расхождения между углами φ1 и φ2 и увеличения численности выборок значение критерия возрастает. Чем больше величина φ_эмп, тем более вероятно, что различия достоверны. Критическое значение φ_эмп для уровня значимости 0,05 равно 1,64. То есть, если φ_эмп = 1,64: если φ_эмп < 1,64, то характеристики сравниваемых выборок совпадают на уровне значимости 0,05; а если φ_эмп > 1,64, то достоверность различий характеристик сравниваемых выборок составляет 95%.

3.2.3 Метод жидкостной иммуноцитохимии

Все гастробиоптаты СОЖ, полученные при выполнении фиброэзофагогастродуоденоскопии с прицельной многократной биопсией, помещались в одну пробирку со стерильным фосфатным буфером. Пробирку с содержимым интенсивно встряхивали несколько раз, а гастробиоптаты вынимали, гомогенизировали и помещали в другую пробирку с 2,5 мл свежего буфера. Полученную суспензию подвергали центрифугированию на роторной центрифуге в течение 10 минут со скоростью 1600 об/минуту, затем из надосадочной жидкости готовили концентрированные монослойные цитологические препараты с использованием цитоцентрифуги CytoFuge2. Для этого надосадочную жидкость в объеме 200 мкл помещали в фильтр-концентратор и центрифугировали в течение 10 на скорости 1600 об/минуту. Полученные монослойные цитологические препараты фиксировали смесью спирт: ацетон в соотношении 1:1 и затем окрашивали иммуноцитохимическим методом в авидин-биотиновом варианте, который включал следующие этапы:

·        промывку в двух сменах трис- NаСL - буфера по 5 минут;

·        блокировку эндогенной пероксидазы в 3% растворе перекиси водорода на метаноле в холодильнике при + 4ºС в течение 30 минут;

·        промывку в двух сменах трис-NaCL - буфера по 5 минут,

·        инкубацию с нормальной сывороткой - 30 минут;

·        инкубацию с первыми кроличьими поликлональными антителами к антигенам клеточной стенки H.pylori (DAKO) в течение одного часа при комнатной температуре;

·        промывку в двух сменах трис-NaCL - буфера по 5 минут;

·        инкубацию со вторыми антикроличьми мышиными антителами (DAKO) 30 минут во влажной камере;

·        промывку в двух сменах трис-NaCL - буфера по 5 минут;

·        инкубацию с авидин-биотиновым (DAKO) комплексом 30 минут;

·        промывку в двух сменах трис-NaCL - буфера по 5 минут;

·        проявление пероксидазы диаминобензидином (DAKO) (под контролем микроскопа);

·        промывку дистиллированной воде 5 минут;

·        докрашивание гематоксилином Майера 1 минуту.

.3 Результаты исследований, их анализ и обсуждение

.3.1 Результаты жидкостной иммуноцитохимии

Технологией жидкостной цитологии было обработано и окрашено иммуноцитохимическим методом 8 гастробиоптатов из антрального отдела желудка. Ввиду того, что у нас не стояло задачей количественное определение НР в СОЖ пациента, а лишь установление достоверности присутствия некоторого количества кокковых форм, все гастробиоптаты обрабатывались одновременно. В результате было получено 24 препаратов: 16 из гомогенизированных гастробиоптатов и 8 из смыва с гастробиоптатов. Во всех препаратах были выявлены бактериальные клетки, имеющие специфическое для H.pylori окрашивание.

После проведенной иммуноцитохимической реакции в препаратах, приготовленных из гомогенизированных гастробиоптатов, бактериальные клетки H.pylori (спиралевидные и кокковые формы) окрашивались диаминобензидином в цвета от темно-коричневого до насыщенного черного.

Размеры спиралевидных форм бактериальных клеток НР варьировали от 3-5 мкм в длину и составляли около 0.5 мкм в поперечнике. Нередко наблюдались спиралевидные формы, соединенные между собой последовательно образуя цепочку.

Кокковые формы НР имели размеры от 0.5 до 1мкм в диаметре, идеально округлую форму и окрашивались равномерно с несколько большей интенсивностью, чем спиралевидные формы НР.

Рисунок 13 - Бактериальные клетки Helicobacter pylori, выявленные иммуноцитохимическим методом, в препарате, приготовленном из гомогенизированного биоптата слизистой оболочки желудка методой ЖЦ. Стрелкой обозначена кокковая форма НР. Увеличение 1000х.

Рисунок 14 - Кокковая форма Helicobacter pylori, выявленная иммуноцитохимическим методом, в препарате, приготовленном из гомогенизированного биоптата слизистой оболочки желудка методой ЖЦ. Увеличение 1000х.

А в препаратах суспензий клетки выглядели менее четко, были заметно менее спиральными (рисунки 15-16). Возможно, это связано с изменениями в структуре пептидогликана, отвечающего за форму бактерии, при достаточно длительном контакте с фосфатным буфером.

Рисунок 15 - Бактериальные клетки Helicobacter pylori, выявленные иммуноцитохимическим методом, в препарате, приготовленном из смыва с биоптата слизистой оболочки желудка методом ЖЦ. Увеличение 1000х.

Рисунок 16 - Кокковая форма Helicobacter pylori, выявленная иммуноцитохимическим методом, в препарате, приготовленном из смыва с биоптата слизистой оболочки желудка методом ЖЦ. Увеличение 1000х.

Тем не менее, можно утверждать, что нам удалось выявить истинные кокковые формы НР и что частоты их встречаемости в цитоцентрифугатах после ЖЦ совпадают с частотами встречаемости кокковых форм в прямых цитологических препаратах - мазках-отпечатках СОЖ (3-5%).

3.3.2 Количественная и полуколичественная оценка степени обсемененности СОЖ кокковыми формами

В рамках данного дипломного проекта был выполнен анализ данных о пациентах, поступивших в клинику в 2008 году с диагнозом хронический HP-ассоциированный гастрит. Было установлено процентное содержание кокковых форм в 220 препаратах, полученных из антрального отдела желудка и окрашенных иммуноцитохимическим методом. В результате получены гистограммы, характеризующие частоту встречаемости кокковых и У-форм в СОЖ по количественной и полуколичественной шкале.

Рисунок 17 - Распределение H.pylori-инфицированных пациентов с диагнозом хронический гастрит по признаку "частота встречаемости кокковых форм в СОЖ". На круговой диаграмме изображено полуколичественное распределение пациентов по степени обсемененности СОЖ кокковыми формами НР

На рисунке 17 представлено распределение 220 пациентов с диагнозом "хронический гастрит" по показателю "частота встречаемости кокковых форм НР в СОЖ". Из представленной гистограммы видно, что существует один модальный класс, соответствующий содержанию кокковых форм 5-10%.

Отметим, что для оценки степени обсемененности СОЖ кокковыми формами НР была предложена, опубликована и используется по настоящее время полуколичественная шкала, содержащаяся в разделе 3.1.1.

В гистограмме (рисунок 17), мы попытались с помощью цветовой маркировки выделить пациентов, которые в случае их оценки по полуколичественной шкале соответствовали градациям:

Очевидно, что представленная гистограмма, которую можно рассматривать как количественную шкалу, вполне соответствует ранее принятой полуколичественной.

Однако, мы считаем, что в дальнейшем для количественной оценки бациллярно-кокковой трансформации H.pylori необходимо к кокковым формам причислять и U-формы, так как очевидно, что они являются неотъемлемой частью трансформации из спиральных форм в кокковые. Поэтому, если мы будем проводить анализ сезонных колебаний активности бациллярно-кокковой трансформации НР в СОЖ, то для точной ее оценки необходимо рассмотреть аналогичные распределения для пациентов, где показателем активности бациллярно-кокковой трансформации была бы частота встречаемости не только кокковых форм, но и добавленная к ним частота встречаемости переходных U-форм.

Рисунок 18 - Распределение H.pylori-инфицированных пациентов с диагнозом хронический гастрит по признаку "частота встречаемости кокковых и U-форм в СОЖ".

На круговой диаграмме изображено полуколичественное распределение пациентов по степени обсемененности СОЖ кокковыми и U-формами НР. Из рисунка 18, отражающего распределение H.pylori-инфицированных пациентов с диагнозом хронический гастрит по признаку "частота встречаемости кокковых и U-форм в СОЖ" видно, что характер распределения ассиметричный, двухвершинный, с асимметрией вправо и что среди НР-инфицированных существует модальный класс, соответствующих содержанию кокковых форм 5-8% и субмодальный класс - 12-22%. Мы так же можем утверждать, что практически все пациенты из этого класса (кокки + U-формы > 11%) соответствуют пациентам с максимальной полуколичественной оценкой "к +++". Поэтому именно по показателю "к +++" мы провели анализ сезонных колебаний бациллярно-кокковой трансофрмации. Учитывая, что в этом распределении учитывались так же и U-формы НР, которые не учитывались ранее, этот класс соответствует содержанию кокковых форм больше 10%. В базе данных за 2002-2009 годы среди H.pylori-инфиццированных пациентов с хроническим гастритом доли пациентов, относящихся к каждому классу, распределены следующим образом: