Дипломная (вкр): Изучение сезонного биоритма бациллярно-кокковой трансформации бактерии Helicobacter pylori

.6.2 Метод жидкостной иммуноцитохимии

В последнее время активно развивается метод жидкостной цитологии (ЖЦ). Суть метода заключается в том, что клеточный материал не переносится сразу на стекло, а смывается в подготовленный стабилизирующий раствор и отправляется в лабораторию. В условиях лаборатории при помощи специального оборудования происходит приготовление стандартного цитологического препарата из присланной суспензии клеток. В силу распределения материала на предметном стекле в виде монослоя снижается количество ложноотрицательных результатов цитологического исследования.

На материале слизистой оболочки желудка метод был впервые применен для диагностики доброкачественных и злокачественных поражений желудка в исследовании Никитиной Л.В. и соавторов "Иммуноцитохимические исследования и жидкостная цитология в диагностике поражений желудка", опубликованном в 2012 году. [49]

В доступной литературе мы не встретили данных о применении метода ЖЦ для бактериальных суспензий. Тем не менее, в препаратах ИЦХ из прямых мазков-отпечатков может присутствовать посторонняя кокковая флора, которая в присутствии эндогенного биотина и пероксидазы, продуцируемой лейкоцитами, а так же в результате опсонизации вполне может окрашиваться хромогеном ДАБ и на неспецифическом фоне выглядеть идентично кокковым формам H.pylori.

ЖЦ предусматривает получение отмытого от неспецифического фона материала в виде клеточной суспензии, с последующим цитоцентрифугированием на предметное стекло. В полученных монослойных мазках-цитоцентрифугатах проводят ИЦХ исследование, которое исключает неспецифическое окрашивание.

.7 Сезонность инфекционных заболеваний

Сезонные колебания болезней и смертей среди людей и животных известны уже многие века. Еще Гиппократ отмечал, что "осенью болезни бывают самые острые и самые смертельные; весна, напротив, самое здоровое время и менее всего несет смертности". В те времена сезонным изменением погоды объясняли многие болезни, такие как туберкулез, астма, фурункулы, язвы. Сезонные циклы инфекционных заболеваний можно отнести к изменениям в метеорологических условиях и светового периода, распространенности и вирулентности возбудителя, поведению самого человека и сезонным изменениям его иммунитета. Выявление факторов, играющих решающую роль в устойчивости человека к инфекционным заболеваниям в течение части года, может иметь большое значение для лечения и профилактики этих болезней.

Давно известны и математически описаны регулярные вспышки различных инфекционных заболеваний, сезонность которых сохраняется даже после искоренения крупных эпидемий (корь, менингит, пиелонефрит). Вспышки таких заболеваний приходятся на разные сезоны, но для каждого возбудителя их сроки и характеристики удивительно последовательны из года в год. Наблюдается так же удивительная согласованность времени наступления вспышек заболеваний в различных географических районах для, например, ротовируса, гриппа, полиомиелита. Интересно так же, что регулярные и предсказуемые картины сезонных вспышек доминируют в эпидемиологии исключительно человеческих патогенов.

Чаще всего периодичность вспышек инфекционных заболеваний объясняют изменениями в условиях окружающей среды. Замечены корреляции между эпидемиологическими циклами и циклами температур, влажности, осадков и ветра. Правда, не всегда таким корреляциям находят подходящее биологическое обоснование.

Либо объяснение находится, но корреляция наблюдается не всегда. Например, в одних областях (Орегон) пик менингококковой инфекции наблюдается во время сезона дождей, а в других - во время сезона сухих ветров (Африка южнее Сахары).

Рисунок 9 - Сезонное изменение в возникновении трех человеческих патогенов в США: A - краснуха, B - вирус гриппа, C - ротавирус [50]

Но бывают и достаточно ясные случаи. Например, риновирус активно реплицируется при низких температурах, а зимой в носу как раз около 34С или даже меньше. Распространение пиелонефрита летом связывают с мухами, которые являются его переносчиками и отсутствуют в холодное время года.

Так же регулярные изменения полиомиелита, кори и других сезонных заболеваний связывают с изменениями поведения самого носителя - человека. Например, очевидно, что купание в течение летнего сезона способствует распространению инфекций. [50]

Регулярные ежегодные изменения могут быть связаны с восприимчивостью человеческого организма к конкретным возбудителям. Сейчас активно исследуются сезонные изменения в иммунной функции. Например, уровень клеток, участвующих в клеточном иммунитете (Т-киллеры, которые осуществляют лизис поврежденных клеток собственного организма), понижен зимой, а лимфоцитов, ответственных за производство антител (В-клетки и Т-хэлперы), наоборот, повышен. Хотя общий уровень лимфоцитов при этом остается постоянным.

Неизвестны природные сигналы, которые побуждают к сезонным изменениям человеческий иммунитет. Возможно, большую роль в этом играет температура воздуха и фотопериод. Так же возможно, что сезонные различия в гуморальном иммунитете являются приспособительной реакцией к сезонным изменениям бактериальных и вирусных патогенов. [51]

В общем, единой теории сезонности инфекционных заболеваний не существует, и, возможно, она и не может существовать: слишком много факторов и слишком много противоречий.

.8 Сезонность H.pylori-ассоциированных заболеваний

Язвенная болезнь является ярким примером сезонности, обострения ее приходятся в разных регионах на осень, зиму или весну. Несмотря на многочисленные исследования, до сих пор не понятны причины сезонности обострений язвенной болезни. Виноваты могут быть и климатические изменения, и человеческое поведение, и имунные… Хотя многие гастроэнтерологи считают ЯБ системным заболеванием, в развитии которого учувствуют и психосоматические и психосоциальные механизмы, значительные исследования четко установили, что H.pylori, является серьезной причиной язвенной болезни.

Язвенная болезнь желудочно-двенадцатиперстного тракта - это дефект слизистой оболочки в результате повреждения эпителиальных клеток, вызванный едкими веществами - кислотой и пепсином. [52]

В таблице 1 представлены данные о большинстве длительных исследованиях сезонного ритма язвенной болезни

Таблица 1 Сезонные колебания в возникновении ЯБДПК и связанных с ней осложнений в ряде стран и континентов [52]

В чем причина возникновения пиков? Часто находят корреляцию с изменением различных метеоусловий (рисунок 2). Так, в Тайване, выявили обратно пропорциональную зависимость частоты обращений от влажности воздуха и температуры среди пожилых людей (старше 65 лет). Интересно, что вне зависимости от типа климата (субтропический, как в Тайване и Израиле, или умеренный, как в Норвегии), почти всегда выделяются пики во время зимы. Авторы Тайваньской статьи предполагают, что это может быть связано с изменением уровня мелатонина, вызванного фотопериодизмом, а не со стрессом от "суровых зим" [53].

Рисунок 10 - Время ежемесячных госпитализаций с диагнозом ЯБ и средние уровни метеорологических величин [54]

Так же авторы предполагают связь зимнего пика с увеличением интенсивности курения в осенне-зимние месяцы, а небольшого пика заболеваемости летом среди подростков - со стрессом, который обычно сопутствует вступительным экзаменами.

Существует еще множество факторов, потенциально прямо или косвенно участвующих в рецидивах язвенной болезни: это и курение, и респираторные заболевания, и прием нестероидных противовоспалительных средств, а так же различные метеорологические условия и изменения иммунной функции. Существуют некоторые предварительные данные о наличии циркадных ритмов рН желудка, пищеварительных ферментов, репликации клеток слизистой оболочки и кровоснабжения. [52]

Сезонность инфекции H.pylori является еще одним возможным фактором, который может повлиять на язвенную болезнь. Немецкие исследователи в 1999 году обнаружили годичный ритм распространенности H.pylori, параллельный ритму язвенной болезни. Правда, выборка в этом исследовании достаточно маленькая - 1076человек. Тем не менее, было достоверно обнаружено, что пик распространенности H.pylori приходится на декабрь (59,9%), май (55,6%), февраль (46,7%), сентябрь (45,7%) и октябрь (43,4 %). Распространенность H.pylori в другие месяцы года была менее чем 35% (р <.001). В целом, пик частоты язвенной болезни наблюдался осенью, как и в большинстве докладов на эту тему [55].

Рисунок 11 - Сравнение годичного распределения НР-положительных и НР-отрицательных анализов для каждого месяца (открытые столбцы - отрицательный анализ, темные столбцы - положительный) [55]

В тоже время, Savarino и соавт. [54] не нашли никакой разницы в процентах H.pylori-инфицированных язвенников между сезонами или параллели между ежегодными колебаниями кислотности желудочного сока и H.pylori-инфекции.

Весьма интересно исследование 2011 года об эффективности эрадикации H.pylori в зависимости от времени года. Исследование проводилось среди 512 пациентов, прошедших эрадикацию стандартной тройной терапией, с диагнозом язва двенадцатиперстной кишки функциональная диспепсия. Данные исследования представлены в таблице 2.

Таблица 2 Успешность эрадикации в различные времена года [56]

Наилучшие результаты эрадикации были в декабре - 83,8%, наихудшие в сентябре - 54,1%.

Регрессионный анализ показал, что сезоны влияют на темпы ликвидации самостоятельно (г = 0,009).

Авторы сделали вывод, что успех первой линии эрадикационной терапии (стандартная тройная терапия) претерпевает сезонные изменения. Причинами для этого могут быть сезонные изменения в популяции бактерий (плотность/патогенетических факторов/резистентность к противомикробным препаратам), иммунитет хозяина или экологические факторы (климат, питание) [56].

Таким образом, данные представленного обзора указывают на патогенность НР, особенно их кокковых форм в развитии кислотозависимых заболеваний и роли кокковых форм в распространении НР-инфекции. Очевидна выраженная сезонность НР-ассоциированных заболеваний, и, следовательно, сезонные обострения ЯБ могут быть связаны с активностью бактериальных клеток, инфицирующих СОЖ. Учитывая, что бактериальные клетки H.pylori проявляют бациллярно-кокковый диморфизм (т.е. присутствуют в СОЖ в спиралевидных и кокковых формах), то бациллярно-кокковая трансформация (переход спиралевидных форм в кокковые и наоборот) может рассматриваться как проявление активности жизнедеятельности этого микроба в СОЖ.

2. Цели и задачи работы

бактерия кокковый бациллярный воспалительный

Цель:

Изучить особенности сезонного колебания показателя "степень обсемененности СОЖ кокковыми формами", и изучение сезонного биоритма бациллярно-кокковой трансформации H.pylori в антральном отделе желудка.

Задачи:

1. Создать базу данных эндоскопических диагнозов и результатов иммуноцитохимических анализов, пригодную для последующей аналитической обработки.

. Определить характер распределения пациентов по показателю "частота встречаемости кокковых форм в СОЖ".

. Провести контрольное ИЦХ исследование гастробиоптатов методом ЖЦ на предмет присутствия в них истинных кокковых форм, а так же определить частоту их встречаемости среди всех бактериальных клеток H.pylori .

. Изучить и представить графически сезонные колебания показателя "степень обсемененности СОЖ кокковыми формами".

3. Экспериментальная часть

.1 Характеристика исходных данных

На протяжении 8 лет, с 2002 по 2009 год, в клинике МЧС проводилось большое количество исследований мазков-отпечатков, полученные при эндоскопическом обследовании из биоптатов антрального отдела СОЖ. Основным методом исследования был иммуноцитохимический (см. п. 1.7), который позволил оценить соотношение кокковых и бациллярных форм H.pylori в антральном отделе желудка для порядка 5000 пациентов.