Дипломная (вкр): Изучение сезонного биоритма бациллярно-кокковой трансформации бактерии Helicobacter pylori

Хотя активность in vivo не достаточно изучена, авторы предполагают, что в желудке H.pylori может высвобождать антимикробные пептиды путем так называемого "дружественного лизиса" с целью остановить рост быстрорастущих микроорганизмов. Возможно, H.pylori важна для поддержания нормального баланса микрофлоры человека. [12]

.4 Механизм развития воспалительных заболеваний

Итак, H.pylori попадает в организм человека фекально-оральным или орально-оральным путем и начинает там жить. Часто заражение происходит еще в детстве, наибольший процент инфицированности (до 75%) приходится на детей до 10 лет [30].

Механизм развития H.pylori-зависимых заболеваний пищевого тракта изучен недостаточно, но ясно, что для укоренения в организме большое значение имеют подвижность микроба, хемотаксис (основной хемоаттрактант - мочевина), наличие адгезина, ацидотолерантность и уреаза, которую имеют все штаммы, независимо от вирулентности или происхождения, которая участвует в активации фагоцитов [31]. Все эти факторы, вместе с некоторыми саg-белками, вызывают воспалительную реакцию слизистых оболочек. H. pylori стимулирует также образование гастрина, что, в свою очередь, усиливает продукцию соляной кислоты обкладочными клетками слизистой желудка. На все это наслаивается действие цитотоксина VacA, который вызывает вакуолизацию клеток эпителия, а возможно и плазмина, гидролизующего белки, в частности, фибронектин. В результате возникают гастриты, изъязвление слизистой, лимфома желудка (MALToMa), рак желудка. Показано, что более 2/3 случаев язвенной болезни, лимфомы слизистой оболочки желудка и рака дистального отдела желудка, связаны с инфекцией H.pylori.[32,33].

Обсеменение слизистой оболочки желудка HP сопровождается развитием поверхностного антрального гастрита и дуоденита и ведет к повышению уровня гастрина и снижению уровня соматостатина с последующим усилением секреции соляной кислоты. Избыточное количество соляной кислоты, попадая в просвет двенадцатиперстной кишки, в условиях относительного дефицита панкреатических бикарбонатов способствует прогрессированию дуоденита и, кроме того, обусловливает появление в двенадцатиперстной кишке участков желудочной метаплазии (перестройки эпителия дуоденальной слизистой оболочки по желудочному типу), которые быстро заселяются HP. В дальнейшем при неблагоприятном течении, особенно при наличии дополнительных этиологических факторов (наследственная предрасположенность, 0(1) группа крови, курение, нервно-психические стрессы, алиментарные погрешности, прием ульцерогенных лекарственных препаратов и др.), в участках метаплазированной слизистой оболочки желудка формируется язвенный дефект. [31]

1.5 Бациллярно-кокковая трансформация H.pylori

Особый интерес представляет способность H.pylori превращаться из спиралевидной в кокковую форму. Впервые это было обнаружено при попытках культивирования выделенных от H.pylori-обсемененных больных спиралевидных форм. Большинство исследователей считают, что кокковые формы - приспособительная реакция бактерии к неблагоприятным условиям. При исследованиях H.pylori в культуральной среде, переход спиралевидных форм H.pylori в кокковые связывают с повышением рН и накоплением токсических продуктов жизнедеятельности [34]. Но вопрос о трансформации H.pylori, особенно в естественных условиях, все еще не до конца раскрыт.

.5.1 Кокковые формы H.pylori

Тот факт, что кокковые формы H.pylori не культивируется in vitro, привел некоторых авторов к предположению, что они являются дегенерирующими или мертвыми формами бактерии. Но в тоже время ряд исследований доказывает, что они могут сохранять метаболическую активность, хотя и в меньшей степени, чем активные пролифирирующиее клетки.

Было убедительно показано, что кокковые формы H. pylori сохраняют клеточные структуры, свойственные спиралевидным формам H.pylori, но некоторые из антигенов (CagA и porin) в ходе трансформации спиралей в кокки исчезали. Поэтому кокковые формы H.pylori могут рассматриваться как вполне жизнеспособные и представлять собой одну из стадий биологического цикла H.pylori [38].

Часто в условиях in vitro кокки HP встречаются в двух формах, - дегенеративные и истинные. По ультраструктурным признакам выделяют HP кокки типа А (дегенеративные) и типа В (истинные). Тип А характеризуется нерегулярными поверхностными и внутрицитоплазматическими структурами, которые плотно смыкались друг с другом. Тип B имеет гладкую поверхность с нитями (флагеллами), намотанными вокруг его собственного тела, а также строго перепончатые структуры. [39] Тип А часто можно наблюдать у пациентов, прошедших эрадикацию.

Кокковые формы типа В сохраняют способность синтезировать белки после 100 дневной инкубации в фосфатном буфере или в дистиллированной воде при 4С [40], а так же при культивировании в анаэробных условиях в течение 7 дней [41]. Показана способность истинных кокковых форм к адгезии и инвазии эпителиальных клеток [42]. Дольше всего кокковые формы сохраняются в изотонической среде при температуре ниже 15⁰С, тогда как при t=37⁰C они быстро теряют жизнеспособность. [43]

Ранние стадии кокковых форм сохраняют жгутики и подвижность, аналогичную спиральным формам, а также полярную мембрану, ассоциированную с базальным комплексом жгутиков. Эксперименты на гнотобионтах показали что неподвижные или малоподвижные штаммы H.pylori менее вирулентны, чем подвижные штаммы. Лишь небольшое количество кокковых форм H.pylori обладает полным набором жгутиков и сохраняет метаболическую активность, обеспечивающую их подвижность, сравнимую к таковой у спиралевидных форм.

Содержание уреазы в кокковых формах H.pylori снижено на 40 % по сравнению со спиралевидными формами. Несмотря на то, что при трансформации в кокковые формы H.pylori возможна утрата уреазной активности, в них посредством полимеразной цепной реакции продолжают выявляться гены, кодирующие уреазу (белок 26-kDa). [43]

Вирулентность кокковых форм HP была показана в эксперименте с заражением мышей. Три штамма H. pylori, изолированных из гастробиоптатов пациентов с язвами, были конвертированы из спиралевидных форм в кокковые формы, путем перенесения и выдерживания в стерильной воде. Одну группу мышей линии BALB/c заражали кокками HP, а другую заражали спиралевидными формами путем внутрижелудочного введения. Хеликобактериоз в СОЖ у инфицированных мышей подтверждали гистологическим и уреазным методами. На 21-й и на 28-й день после прививки в обеих экспериментальных группах путем электронной микроскопии в СОЖ зараженных мышей были выявлены спирали, бациллы и кокки. Гистологическое исследование показало повреждение клеток эпителия СОЖ, появление язв и эрозий. СОЖ была повреждена в большей степени у мышей, инфицированных кокками H. pylori. Подобных результатов не было получено в контрольной группе животных, которым внутрижелудочно вводили стерильную воду. Представленные экспериментальные данные указывают на патогенность кокковых форм HP, т.е. на их способность колонизировать СОЖ и вызывать гастриты. Также, очевидно, что кокковые формы хеликобактера могут трансформироваться обратно в спиралевидные формы. [44] Предполагается, что при фекально-оральном пути, который рассматривается как основной путь распространения H.pylori, заражение происходит именно через его кокковые формы [43].

Имеются предварительные данные, указывающие на то, что именно в период трансформации спиралевидных форм H.pylori в кокковые наблюдается максимальная активизация продукции ими активных форм кислорода. Различные конформационные типы неспиралевидных форм H.pylori обладают особенностями метаболизма, направленными на повышение устойчивости микроорганизма к различным экзогенным, в том числе и к терапевтическим воздействиям. [43]

В слизистой оболочке желудка встречаются и спиральные, и кокковые формы H.pylori, причем в разных соотношениях. Первый вариант H.pylori - обсемененности СОЖ - кокко-бациллярный (сочетанным). Он характеризуется тем, что в одном биоптате одновременно присутствуют и спиралевидные и кокковые формы H.pylori. Второй вариант H.pylori - обсемененности СОЖ - бациллярный. При этом варианте в биоптате присутствуют только спиралевидные формы H.pylori. И, наконец, в третьем варианте H.pylori - обсемененности СОЖ, в гастробиоптатах обнаруживаются только кокковые формы H.pylori.

Важно отметить, что и у пациентов после эрадикации в биоптатах слизистой оболочки желудка кокковые формы H.pylori могут преобладать над спиралевидными, в большинстве случаев в биоптатах из антрального отдела желудка [46].

Таким образом, имеющиеся литературные данные указывают на то, что наряду с дегенерирующими бактериальными клетками H.pylori, которые имеют свои морфологические особенности и внешне выглядят как кокки, существуют и истинные - жизнеспособные кокковые формы H.pylori, которые имеют свои морфологические критерии и способны трансформироваться обратно в спиралевидные формы. К тому же, они выдерживают больший диапазон рН, способны сохраняться анаэробных условиях и в холодной воде, а так же более устойчивы к антибиотикам.

1.5.2 Механизмы возникновения кокковых форм из бациллярных

1. Установлено, что в условиях in vitro, Helicobacter pylori трансформируется из бациллярной (спиралевидной формы) в кокковую через промежуточное звено - U-форму. [35]. Начальная стадия трансформации в кокковую форму сопровождается конденсацией протоплазматического матрикса и увеличением перипластического пространства на одном из полюсов бактериальной клетки (обычно на полюсе, противоположном базальному комплексу жгутиков). Увеличение объема перипластического пространства приводит к растяжению клеточной стенки и оттеснению протоплазматического матрикса на периферию с образованием С-образных или U-образных форм. Эти формы являются промежуточным звеном между спиралевидными и кокковыми формами бактерий. Полностью сформировавшиеся кокковые формы сохраняют основную схему строения бактериальной клетки, и характеризуются четко выраженной клеточной стенкой, перипластическим пространством и цитоплазматической мембраной.

Рисунок 1 - Ультраструктура перехода из бациллярной формы в кокковую.

Ультратонкие срезы 2-дневной культуры H.pylori (A), показано инициирование перехода от бактериальной в кокковую форму с образованием плотного периплазматического материала (стрелка) (масштаб 400 нм) на 3 день (B) показано накопление плотного материала в периплазматическом пространстве (стрелка) (масштаб 400 нм), на 4 день (С), показана изогнутая внутрь бактериальная форме, которая представляет собой промежуточный шаг между бациллярной и кокковой формами (масштаб 400 нм); в день 5 (D), показано изменение в цилиндре протоплазмы (масштаб 400 нм) и на 7 день (E), полный вид кокковой формы (масштаб 400 нм) [35]

Вполне вероятно, что такой сценарий трансформации справедлив и для условий in vivo, так как методом иммуноцитохимического анализа в мазках-отпечатках гастробиоптатов U-формы часто встречаются одновременно с кокковыми.

Рисунок 2 - Бактериальные клетки спиралевидных и кокковых форм, диплококковой формы и U-формы Helicobacter pylori, выявленные иммуноцитохимическим методом. Мазок-отпечаток биоптата слизистой оболочки желудка. Увеличение 1000х.

. Как уже упоминалось, наряду с жизнеспособными кокковыми формами, представляющими собой плотные гладкие структуры, встречаются и дегенеративные формы, характеризующиеся нерегулярными поверхностными и внутрицитоплазматическими структурами. Возникновение таких форм, по-видимому, связано непосредственно с гибелью бактериальных клеток.

Рисунок 3 - Бактериальная кокковая клетка Helicobacter pylori дегенеративной формы (отмечена стрелкой), выявленная иммуноцитохимическим методом в биоптате слизистой оболочки желудка у пациента через месяц после эрадикации. Увеличение 1000 х.

3. В ряде случаев, иммуноцитохимическим окрашиванием в препаратах из СОЖ обнаруживались события (см. рисунки 5-7), объяснение которым стало возможным дать только после выхода в январе 2013года статьи Specht M. и соавторов "Localization of FtsZ in Helicobacter pylori and Consequences for Cell Division" [36]. Эта статья посвящена изучению процесса деления клетки H.pylori путем визуализации Z-кольца - кольца сжатия, которое формируется в области сайта деления клетки. Главной структурной и функциональной единицей кольца является нуклеотидсвязывающий белок FtsZ, способный к полимеризации-деполимеризации. С помощью зеленого флуоресцентного белка, связывающего FtsZ, было показано, что деление H.pylori в 50% случаев происходит ассиметрично, размеры дочерних клеток сильно отличаются. Результаты подтверждены электронно-сканирующей микроскопией.

Рисунок 4 - Покадровая микроскопия комплекса FtsZ-GFP. Белые треугольники обозначают полярные очаги FtsZ; желтые треугольники обозначают кольца Z. Спиральные метки отмечены белыми звездочками. Цифры указывают время в минутах. FM, мембранные пятно FM4-64. Нижняя панель показывает наложение комплекса FtsZ-GFP (зеленый) на мембрану FM4-64 (красный).

Дифференциальный интерференционный контраст. Масштаб - 2 мкм [36]

Таким образом, путь клеточного деления H.pylori сильно отличается от E. coli и B. subtilis. Так же авторы изучили локализацию жгутиков в дочерних клетках и пришли к заключению, что большие и малые клетки не различимы с точки зрения получения жгутиков, они всегда наблюдаются на обоих полюсах клетки, даже непосредственно перед ее делением. Причины, вызывающие ассиметричное расположение Z-кольца, неизвестны. Авторы не исключают, что асимметрия вызвана неравномерным ростом частей клетки, но предполагают возможность существования неких специфических факторов асимметрии, происхождение которых еще предстоит выяснить. [36]

Рисунок 5 - Бактериальные клетки спиралевидных форм Helicobacter pylori, выявленные иммуноцитохимическим методом, в биоптате слизистой оболочки желудка. Стрелкой отмечена клетка, предположительно находящаяся в процессе неравномерного деления. Увеличение 1000х.

Рисунок 6 - Бактериальные клетки Helicobacter pylori в слизистой оболочке желудка. Окраска азур 2 - эозином по Романовскому. Стрелкой отмечена клетка, предположительно находящаяся в процессе неравномерного деления. Увеличение 1000х.

Рисунок 7 - Бактериальные клетки спиралевидных форм Helicobacter pylori, выявленные иммуноцитохимическим методом, в биоптате слизистой оболочки желудка. Стрелкой отмечена клетка, предположительно находящаяся в процессе неравномерного деления. Увеличение 1000х.

Возможно, что в результате дробления большой спиральной бактериальной клетки может получиться спираль поменьше ("большой брат") и кокк ("маленький брат").

.6 Иммуноцитохимический метод диагностики

.6.1 Авидин-биотиновый метод

Принцип иммууноцитохимического метода схож с иммуноферментным анализом. В частности, авидин-биотиновый метод основан на высокой аффинности авидина или стрептавидина к биотину (константа диссоциации 10^-19М). Авидин - это гликопротеин с молекулярной массой 68 кД, имеющий высокое сродство к биотину - витамину с малой молекулярной массой. Высокая чувствительность авидин-биотинового метода обусловлена химической структурой авидина, имеющего четыре участка для связи с биотином. Однако из-за молекулярной ориентации биотин-связывающих участков, на самом деле связывается не менее 4 молекул биотина. Метод включает следующие основные этапы инкубации: с немечеными первыми (специфичными) антителами; со вторыми биотинилированными антителами; с комплексом авидина с биотинилированной пероксидазой, с последующим проявлением пероксидазы хрена субстратом диаминобензидином [47].

Рисунок 8 - Авидин - биотиновый метод

Таким образом, принцип иммуноцитохимического метода основан на высоко специфическом связывании антител, которые в дальнейшем можно визуализировать путем химической реакции, с антигенами клеточной стенки H.pylori. В результате проведенной иммуноцитохимической реакции только те бактериальные клетки, в том числе и кокки, которые имеют антигены, специфичные для H.pylori, будут иметь характерное окрашивание.

Иммуноцитохимическое выявление различных форм H. рylori (спиралевидных и кокковых) достаточно редко применяется в медицинской практике, ввиду своей дороговизны и трудности пробоподготовки. При этом он имеет неоспоримую ценность при контроле эффективности эрадикации, потому что при окраске цитологических мазков рутинными методами, невозможно отличить кокковые формы Н. pylori от кокков других видов [48].