ВЫПУСКНАЯ КВАЛИФИКАЦИОННАЯ РАБОТА НА ПОЛУЧЕНИЕ СТЕПЕНИ БАКАЛАВРА
Тема
ИЗУЧЕНИЕ
СЕЗОННОГО БИОРИТМА БАЦИЛЛЯРНО-КОККОВОЙ ТРАНСФОРМАЦИИ БАКТЕРИИ HELICOBACTER PYLORI
Реферат
Бакалаврская квалификационная работа 49 с., 20 рис., 5 табл., 57 источников.
HELICOBACTER PYLORI, ИММУНОЦИТОХИМИЯ, БАЦИЛЛЯРНО-КОККОВАЯ ТРАНСФОРМАЦИЯ, ЯЗВЕННАЯ БОЛЕЗНЬ, СЕЗОННЫЙ БИОРИТМ.
Объектом исследования
Цель бакалаврской работы - изучение особенностей сезонного колебания показателя "степень обсемененности СОЖ кокковыми формами" и изучение сезонного биоритма бациллярно-кокковой трансформации H.pylori в антральном отделе желудка.
В ходе исследования были собраны данные, необходимые для анализа бациллярно-кокковой трансформации H.pylori в антральном отделе желудка, доказана адекватность применяемой полуколичественной шкалы оценки степени обсемененности слизистой оболочки желудка кокковыми формами H.pylori, методом жидкостной иммуноцитохимии было проведено контрольное исследование кокковых форм Н.pylori в антральном отделе желудка.
В результате исследования были получены данные, свидетельствующие о
сезонном колебательном характере бациллярно-кокковой трансформации бактерии Helicobacter pylori.
Содержание
Введение
1. Аналитический обзор
1.1 История исследований
.2 Морфология и метаболизм Helicobacter pylori
.3 Патогенность H. pylori
.4 Механизм развития воспалительных заболеваний
.5 Бациллярно-кокковая трансформация H. pylori
1.5.1 Кокковые формы H. pylori
.5.2 Механизмы возникновения кокковых форм из бациллярных
1.6 Иммуноцитохимический метод диагностики
.7 Сезонность инфекционных заболеваний
.8 Сезонность H.pylori-ассоциированных заболеваний
2. Цели и задачи работы
. Экспериментальная часть
3.1 Характеристика исходных данных
3.3.1 Результаты жидкостной иммуноцитохимии
.3.2 Количественная и полуколичественная оценка степени обсемененности СОЖ кокковыми формами
.3.3 Сезонный биоритм активности бациллярно-кокковой трансформации Н.pylori в слизистой оболочке желудка
Выводы
Список литературы
elicobacter pylori - это короткая, граммотрицательная, извитая, микроаэрофильная бактерия, инфицирование которой может привести к развитию хронического гастрита, язвенной болезни желудка и двенадцатиперстной кишки, желудочной лимфомы и аденокарциномы [1-3]. В организме хозяина H.pylori в основном присутствует в спиральной форме, но может трансформироваться в латентную кокковую форму под воздействием стрессовых условий. Некоторые исследователи считают, что такая форма является морфологическим проявлением дегенерации и гибели клетки. Однако большинство авторов склоняются к тому, что кокковые формы жизнеспособны, но некультивируемы, хотя сохраняют клеточную структуру и поддерживают метаболизм и экспрессию белков. Кокковые формы H.pylori переносят более широкий диапазон рН, в большей степени, чем спиралевидные формы устойчивы к неблагоприятным факторам и антибиотикам и при этом не утрачивают вирулентность. Превращение спиралевидных форм H.pylori в кокковые в слизистой оболочке желудка (СОЖ), так же как и в культуральной среде, возможно, обусловлено накоплением токсических продуктов жизнедеятельности H.pylori .
Внутрижелудочная бактериальная инфекция H.pylori является одним из основных этиологических факторов кислотозависимых заболеваний, к которым в первую очередь относится язвенная болезнь (ЯБ). Таким образом, если признавать прямую связь между инфицированием желудка H.pylori и ЯБ, то и сезонные обострения ЯБ могут быть связаны с активностью бактериальных клеток, инфицирующих СОЖ. Учитывая, что бактериальные клетки H.pylori проявляют бациллярно-кокковый диморфизм (т.е. присутствуют в СОЖ в спиралевидных и кокковых формах), то бациллярно-кокковая трансформация (переход спиралевидных форм в кокковые и наоборот) может рассматриваться как проявление активности жизнедеятельности этого микроба в СОЖ.
Идентифицировать кокковые формы H.pylori методом прямой бактериоскопии возможно, если применять иммуноцитохимический метод (ИЦХ), в котором используются антитела, специфичные к антигенам клеточной стенки H.pylori. В мазках из СОЖ, окрашенных на H.pylori ИЦХ методом, можно определять процент встречаемости спиралевидных вегетативных форм, переходных U-форм и кокковых форм бактериальных клеток H.pylori. В лаборатории цитологических исследований ВЦЕРМ имени А.М. Никифорова МЧС России на протяжении 8 лет проводились широкомасштабные ИЦХ исследования H.pylori в СОЖ, причем, ежемесячно этим методом исследовалось в среднем 55 человек. Таким образом, целью данного дипломного проекта было создание базы данных, необходимой для установления сезонной зависимости показателя "степень обсемененности СОЖ кокковыми формами", и изучение сезонного биоритма бациллярно-кокковой трансформации H.pylori в антральном отделе желудка.
Следует отметить, что архив препаратов, в которых определена частота встречаемости кокковых форм, был получен из прямых мазков-отпечатков гастробиоптатов, в которых наряду с клетками покрово-ямочного эпителия, лимфоидными элементами и лейкоцитами, и, собственно, бактериальными клетками H.pylori, могли присутствовать бактерии-кокки, не относящиеся к H.pylori. Такая кокковая флора в присутствии эндогенного биотина и пероксидазы, продуцируемой лейкоцитами, а так же в результате опсонизации бактерий вполне могла окрашиваться хромогеном ДАБ и на неспецифицеском фоне овыглядеть идентично кокковым формам H.pylori. В настоящее время стандартом в ИЦХ методе является пробоподготовка клеточного материала (в том числе должны рассматриваться и бактериальные клетки) технологией жидкостной цитологии (ЖЦ). ЖЦ предусматривает получение отмытого от неспецифического фона материала в виде клеточной суспензии, с последующим цитоцентрифугированием на предметное стекло. В полученных монослойных мазках-цитоцентрифугатах проводят ИЦХ исследование, которое исключает неспецифическое окрашивание.
Целью нашего исследования стало проведение контрольных ИЦХ исследование гастробиоптатов методом ЖЦ на предмет присутствия в них истинных кокковых форм, а так же определение их частоты встречаемости (%) от всех бактериальных клеток H.pylori.
После установления соответствия данных ИЦХ, включающих ЖЦ-пробоподготовку
и данных, полученных с препаратов прямым методом, мы использовали базу архива
для установления сезонного цикла показателя "степень обсемененности
кокковыми формами".
В 1982 году Австралийские врачи Барри Маршалл и Робин Уоррен исследовали гастробиоптаты больных желудочными воспалениями, язвой желудка и двенадцатиперстной кишки. Они обнаружили, что почти у всех больных присутствует неизвестный прежде вид бактерии, который в дальнейшем был назван H.pylori (потому что основное место обитания бактерии - пилорический отдел желудка). Маршаллу удалось его культивировать, а так же показать, что даже пациенты с язвенной болезнью могут быть вылечены путем уничтожения этих бактерий. Правда, это открытие получило признание только после эксперимента Маршалла над самим собой: он сознательно выпил содержимое чашки Петри с культурой бактерии H.pylori, после чего у него развился гастрит. Затем он излечил себя с помощью 14-дневного курса лечения солями висмута и метронидазола [4]
г первооткрыватели бактерии были удостоены Нобелевской премии по физиологии и медицине "за открытие бактерии Helicobacter pylori и ее роли в развитии гастрита и язвы желудка".
Бактерия Helicobacter pylori весьма успешно приспособилась к жизни в экстремальных условиях человеческого желудка. Она грамотрицательная, что уже подразумевает мощную непроницаемую клеточную стенку. Она способна жить в микроаэрофильных условиях. Имеет 4-7 жгутиков, которые позволяют ей крайне быстро двигаться в вязкой среде и таким образом спасаться от агрессивной среды желудка в толстом слое слизи, защищающий от этой среды сам желудок. Обладает способностью формировать биоплёнки, способствующие невосприимчивости бактерии к антибиотикотерапии и защищающие клетки бактерий от иммунного ответа хозяина. [5]
Так же она продуцирует множество ферментов, обеспечивающих ей необходимый уровень метаболизма: уреазу, каталазу, муциназу, оксидазу, гемолизин, щелочную фосфатазу, гамма-глутамилтрансферазу, алкогольдегидрогеназу, глюкосульфосфатазу, протеазу, фосфолипазу, белок - ингибитор секреции соляной кислоты, многочисленные адгезины (к цитоскелету, клеточной мембране, ламинину, холестеролу), цитотоксины белковой природы и др. [6-8]
Не смотря на такое метаболическое разнообразие, H.pylori не способна окислять углеводы. Поэтому метаболизм ее поддерживается за счет энергии, освобождающейся при утилизации трикарбоновых кислот или/и аминокислот. В том числе, H.pylori содержит гидрогеназу, которая может использоваться для получения энергии путём окисления молекулярного водорода, продуцируемого другими кишечными бактериями. [9]
Многочисленными исследованиями доказана патогенность H. pylori, в частности, способность их инициировать воспаление гастродуоденальной слизистой оболочки, хотя, в зависимости от обстоятельств она может вести себя так же, как комменсал и даже как симбионт [13]. Показано, что многие люди, инфицированные H.pylori, остаются бессимптомными носителями [14]. Патогенность данных бактерий обеспечивается их высокой подвижностью, выделением токсинов, способностью к адгезии, способностью активировать медиаторы воспаления, наличием фактора вирулентности [15].
Важно отметить, что более 40 генов патогенности (вирулентности) H.pylori расположены не дискретно, а собраны в одном из сегментов нуклеотида, названном "островком патогенности" [16]. Его маркером считается критический иммунодоминантный белок - CagA с молекулярной массой 120-140 кДа, кодируемый геном cagA (от "cytotoxin associated gene A") [17]. Он, с помощью систем секреции типа III и IV, гены которых так же находится в этой области, транспортируется внутрь клеток и нарушает нормальное функционирование цитоскелета [18]. "Островок патогенности" ответствен за образование основных факторов вирулентности, включая О-боковые цепи ЛПС, сходные или идентичные с антигеном Lewis, а также систем секреции типа III и IV [19]. Отметим попутно, что "островки патогенности" присущи также вирулентным штаммам многих других грамотрицательных, а также грамположительных бактерий и часто отличаются по содержанию Г+Ц от нуклеотидного состава основных хромосом [20].
H.pylori в настоящее время подразделяют на четыре серотипа, в зависимости от выработки микроорганизмами цитотоксина VacA и цитоксинассоциированнного белка CagA: тип I (CagA+, VacA+), тип Ia (CagA+, VacA-), тип Ib (CagA-, VacA+), тип II (CagA-, VacA-) [21].
Вообще геном H.pylori крайне нестабилен, каждый инфицированный индивид является носителем уникального штамма.
В отличие от многих других бактерий, в изолятах Н. pylori идентичные аллели генов встречаются очень редко. И, хотя клиническая картина заболеваний зависит от факторов вирулентности, не обнаружено тесной связи между генотипом (комбинации различных аллелей) и заболеванием пищевого тракта. [22]
Рассмотрим по отдельности факторы, имеющие непосредственное отношение к развитию заболеваний у людей:
Цитотоксин А (VacA)
Этот полипептид с молекулярной массой 55 кДа, вызывает вакуолизацию клеток эпителия путем образования пор в цитоплазматической мембране. Интересной особенностью VacA является утрата им токсичности при обработке формальдегидом при сохранении антигенности, т.е. превращение в анатоксин. [23]
Ica A
Не меньшее значение принадлежит продукту гена iceA, образование которого индуцируется при контакте микроба с эпителиальными клетками. [23]. По данным некоторых авторов, iceA вызывает лимфоцитарную инфильтрацию и эпителиальные повреждения [24], по мнению других, iceA ассоциируется с нейтрофильной активностью, атрофией и интерстициальной метаплазией. Однако функция продукта гена iceA, пока не выяснена. В то же время предполагается, что с цитотоксичностью может быть связан один из поверхностных белков H.pylori, который реагирует с плазминогеном и одновременно с ингибитором-2 плазмина и макроглобулином-2. В итоге происходит превращение плазминогена в плазмин, обладающий высокой протеолитической активностью [21, 24].
Уреаза
Более 15 % белкового синтеза микроорганизма приходится на уреазу. Этот фермент крайне важен для жизни бактерии: он расщепляет мочевину и за счет аммиака нейтрализует Н+- ионы, защищая H.pylori от действия соляной кислоты [25]. В отличие от других патогенных бактерий (кишечная палочка, протей, клебсиеллы, провиденций и морганеллы), уреаза H.pylori располагается не только в ее цитоплазме, но и на поверхности клеток [26]. Это происходит в результате автолиза части клеток и адсорбции фермента на поверхности выживших бактерий. Наличие внеклеточной уреазы имеет большое значение для приживления H.pylori [25]. Будучи сильным антигеном фермент связывает антитела, которые могли бы повредить H.pylori, и комплекс уреаза-антитело удаляется с поверхности клеток (после этого свободная уреаза вновь появляется на поверхности клеток).
Уреаза H. pylori действует как токсин, поскольку ионы аммония, образующиеся при гидролизе мочевины, повреждают эпителий. Уреаза усиливает воспалительные реакции, за счет активации моноцитов и нейтрофилов, стимуляции секреции цитокинов, образования радикалов кислорода и окиси азота; кроме того, большая субъединица уреазы (UreB) действует как аттрактант для лейкоцитов [27]
Адгезины
Для успешной реализации своего патогенного потенциала, бактерии необходимо иметь способность к адгезии к клеткам и элементам соединительной ткани. Выявлено несколько адгезинов, определяющих выбор хозяина и взаимодействующих с эпителиальными клетками [21]. В качестве рецепторов H.pylori использует остатки сиаловых кислот и сульфогруппы гликопротеинов, гликолипидов, фосфолипидов и остатки фукозы Люис-подобных антигенов. Показана также способность микроба прилипать к белкам соединительной ткани, в частности к коллагену, ламинину и витронектину.
Помимо уреазы и адгезинов, к числу факторов, которые предохра-няют H.pylori от действия защитных сил организма и химиотерапевтических средств, относится способность микроба к инвазии эпителиальных клеток. Можно предположить, что вхождение H.pylori в эпителиальные клетки индуцируется самим микробом, подобно тому, как это происходит в случае других видов бактерий [28]
Липополисахарид
Интересной особенностью является то, что липополисахарид (ЛПС) H. pylori имеет в боковых цепях эпитопы, структурно сходные с эпитопами Lewis-антигенов крови (Le), причем штаммы H. pylori могут экспрессировать как Lex,, так и Ley или оба антигена. Эти антигены найдены также в слизистой оболочке желудка и на поверхности лейкоцитов (CD15=Leх). При H.pylori-инфекции за счет ЛПС возбудителя образуются антитела к Lewis -антигенам, причем, эти антитела могут реагировать с аналогичными эпитопами тканей хозяина [29]. При этом происходит фиксация комплемента иммунными комплексами, что вызывает повреждение тканей [37, 38,39]. С другой стороны, наличие у H.pylori эпитопов, присущих также Lewis - антигенам крови, является выражением антигенной мимикрии микроба, в результате чего он не распознается организмом как "чужой" [27]
Антимикробные пептиды
Малоизвестным фактом является антибактериальная активность самой H.pylori. Эта активность была обнаружена при исследовании сырых лизатов бактерий и прослежена до цекропин-подобного пептида, происходящего от N-концевой части рибосомального протеина L1 (RpL1). Это короткая амфифильная альфа-спираль, содержащая большое количество положительно-заряженных аминокислот. На данный момент химически синтезирован и запатентован наиболее сильных из всех своих собратьев пептид H.pylori (2-20), который обладает антибактериальной активностью в отношении многих грамм-положительных и грамм-отрицательных бактерий, а так же дрожжей C. albicans. Механизм действия еще не до конца изучен, но считается, что благодаря обилию положительных остатков АК он обладает сродством к отрицательно-заряженным группам фосфолипидов и вызывает образование поры, ведущей к разрушению бактериальной мембраны. Интересно, что он не только не токсичен для эукариотических клеток, но и обладает противосполительным действием. [10-12]