Материал: Ферменты
присутствии |
избытка |
S |
и |
пропорциональна ей |
при низких |
|
концентрациях S . |
|
|
|
|
|
|
Таким |
образом, |
простая |
кинетическая |
модель, |
описываемая |
|
уравнением |
k1 |
k2 |
+ P , |
может объяснить |
загадочное отсутствие |
|
E + S →ES |
→E |
|||||
|
← |
|
|
|
|
|
k−1
концентрационной зависимости, иногда наблюдаемое в ферментативных реакциях.
wmax |
|
0,5w max |
|
KM |
[S] |
Рисунок 20 – Зависимостьскорости реакцииот концентрациисубстрата
При больших концентрациях субстрата скорость стремится к максимальному значению
|
wmax = k2[E]0 . |
|
||
Из уравнения |
Михаэлиса следует, |
что при w = |
wmax |
константа |
|
||||
|
|
2 |
|
|
Михаэлиса KM =[S] |
– константа Михаэлиса равна концентрации |
|||
субстрата, при которой скорость (стационарной) реакции достигает половины своего максимального значения.
ВОПРОСЫ ДЛЯ САМОКОНТРОЛЯ
1.Запишите уравнение Михаэлиса.
2.От чего зависит максимальная скорость реакции в приближении Михаэлиса-Ментен?
3.Как выражается константа Михаэлиса через концентрацию
субстрата?
40
18. ПРИБЛИЖЕНИЕ ЛАЙНУИВЕРА-БЕРКА
Уравнение Михаэлиса |
w |
= |
wmax [S] |
|
описывает |
гиперболу, и |
|
KM +[S] |
|||||||
|
|
|
|
|
|||
нахождение значений wmax и |
KM |
из зависимости w([S]) |
требует набора |
||||
данных во всем диапазоне концентраций.
Стандартным решением такой проблемы является приведение исследуемой зависимости к уравнению прямой путем преобразования координат. В энзимологии одним из наиболее популярных является подход, предложенный Лайнуивером и Берком.
Преобразуем уравнение Михаэлиса в вид
1 = KM +[S] , w wmax [S]
а затем в уравнение Лайнуивера-Берка (Lineweaver-Burk )
1 |
= |
KM |
|
1 |
|
+ |
1 |
. |
w |
w |
[S] |
|
|||||
|
|
w |
||||||
|
|
max |
|
|
|
|
max |
|
График уравнения Лайнуивера-Берка представляющий собой прямую
|
1 |
, |
1 |
|
|
|
|
|
|
|
|||||||
в координатах |
|
|
|
приведен на рисунке 21. |
|||||||||||||
|
|
|
|||||||||||||||
w |
[S] |
|
|
|
|
|
|
||||||||||
|
|
|
|
|
|
1 |
|
|
|
тангенс угла |
|||||||
|
|
|
|
|
|
|
|
|
|
|
|
наклона = |
|||||
|
|
|
|
|
|
|
w |
|
|
||||||||
|
|
|
|
|
|
|
|
|
= |
KM |
|
|
|
|
|||
|
|
|
|
|
|
|
|
|
|
|
|
|
|||||
|
|
|
|
|
|
|
|
|
|
|
|
w |
|||||
|
|
|
|
|
|
|
|
|
|
|
|
|
|||||
|
|
|
|
|
|
|
|
|
|
|
|
|
max |
||||
|
|
|
|
|
|
|
|
|
|
1 |
|
|
|
|
|
|
|
|
|
|
|
|
|
|
|
|
|
|
wmax |
1 |
|
||||
|
|
|
− |
|
1 |
|
|
|
|
|
|
|
|
|
[S] |
|
|
|
|
|
KM |
|
|
|
|
|
|
|
|||||||
Рисунок 21 – ГрафикЛайнуивера-Берка
41
По графику уравнения Лайнуивера-Берка удобно определять wmax , KM и k2 . Для этого продолжают прямую до пересечения ее с осью абсцисс
иординат.
1.Значение максимальной скорости wmax равно обратной величине
отрезка, отсекаемого прямой Лайнуивера-Берка на оси ординат.
2. Значение константы Михаэлиса KM равно обратной величине отрезка, отсекаемого прямой Лайнуивера-Берка на оси абсцисс.
ВОПРОСЫ ДЛЯ САМОКОНТРОЛЯ
1.Запишите уравнение Михаэлиса в координатах Лайнуивера-Берка.
2.Каким образом по графику Лайнуивера-Берка определить максимальную скорость ферментативной реакции?
3.Каким образом по графику Лайнуивера-Берка определить значение константы Михаэлиса?
19. СМЫСЛ ПАРАМЕТРОВ КИНЕТИКИ МИХАЭЛИСАМЕНТЕН
1. Максимальная скорость ферментативной реакции wmax .
Поскольку wmax = k2[E]0 , то wmax можно использовать в качестве
характеристики количества фермента, присутствующего в неизвестном растворе (для "оценки" активности фермента). Обычно wmax выражают в единицах ферментативной активности, например в международных единицах МЕ (1микромоль /с) при условии, что фермент насыщен субстратом.
На практике измерение активности в крови фермента аспартатаминотрансферазы позволяет в три раза увеличить достоверность диагностирования инфаркта миокарда, при котором резко повышается активность этого фермента в сыворотке крови.
2. Константа Михаэлиса KM . Параметр KM в первую очередь используют для выявления специфичности действия фермента,
поскольку KM характеризует тенденцию фермент-субстратного комплекса
к диссоциации на фермент и субстрат. 42
Сравнивая значения KM для ряда различных субстратов, можно определить, какой тип молекул наиболее прочно связывается с ферментом; как правило, к числу наиболее прочно связывающихся субстратов (т. е. KM малы) относятся "природные" субстраты (субстраты, на которые фермент действует in vivo).
Проводя такие исследования, можно, например, классифицировать различные протеолитические ферменты (ферменты, которые гидролизируют белки) согласно тому, на какие участки полипептидной цепи они действуют. На рисунке 22представлена схема действия некоторых протеолитических ферментов.
Рисунок 22 –Схема, |
иллюстрирующая специфичность действия разных протео- |
|
литическихферментов |
|
|
Например, химорипсин (ЕС 3.4.4.5)расщепляет |
цепь, атакуя |
|
карбоксильный конец связи между тирозином и соседним аминокислотным остатком.
Проявление подобной специфичности часто используется для расщепления белка по заданным участкам перед аминокислотным анализом. Проводя расщепление в нескольких различных (известных) участках и анализируя получающиеся при этом продукты, можно установить аминокислотную последовательность в белке.
На рисунке 23представлена схема фермента лизоцима, аминокислотная последовательность которого была определена с помощью предварительного протеолиза протеолитическими ферментами.
43
Рисунок 23 – Последовательностьаминокислотныхостатков в ферменте лизоцим
3. Значение константы скорости k2 второго этапа реакции. Если концентрация фермента известна (например при работе с очищенными
ферментными препаратами), то из wmax можно определить k2 = wmax . [E]0
Параметр k2 характеризует эффективность ферментативного катализа и используется для получения информации о его механизмах.
k2 – каталитическая константа, часто обозначаемая как kcat или kc –может рассматриваться как число молей продукта, образующихся в единицу времени одним молем чистого фермента, насыщенного субстратом.
Числом превращения называется отношение k2 к числу активных центров в молекуле фермента. Таким образом, число превращения показывает количество молей продукта, образуемых в единицу времени (в1 с) на одном активном центре фермента,насыщенном субстратом.
Как показано в таблице 2, типичные значения чисел превращения лежат в интервале 1–1 000 000.
44
Таблица 2 –Числа превращения для некоторых ферментов
Фермент |
Число превращения |
|
|
Химотрипсин |
1 000 |
|
|
Рибонуклеаза |
100 |
|
|
Карбоксипептидаза |
100 |
|
|
Киназа |
1 000 |
|
|
Каталаза |
5 000 000 |
|
|
Пероксидаза |
10 |
|
|
Карбоангидраза |
36 000 000 |
|
|
Фермент каталаза, катализирующий реакцию 2H 2 O2 → 2H 2 O + O2 , обеспечивает одну из наиболее высоких скоростей превращения, известных для хорошо изученных ферментов.
Каталазная ферментативная система задействована в защитном механизме жука-бомбардира. На кончике брюшка этого жука находится "реакторная железа", содержащая 25% H2O2 . Если потревожить жука, то каталазная реакция протекает так быстро, что за 1с вода в " реакторной железе" нагревается от комнатной температуры до100 °С и под действием образующегося пара в нападающего выстреливается струя кипящей воды.
ВОПРОСЫ ДЛЯ САМОКОНТРОЛЯ
1.Какую информацию о ферментативной реакции дает максимальная скорость ферментативной реакции wmax ?
2.Какую информацию о ферментативной реакции дает константа Михаэлиса?
3.Какую информацию о ферментативной реакции дает значение константы скорости k2 ?
4.Что называется числом превращения фермента?
45
20.СНЯТИЕ ОГРАНИЧЕНИЙ МИХАЭЛИСА-МЕНТЕН:
1.СУЩЕСТВОВАНИЕ ОБРАТНОЙ РЕАКЦИИ
Если обратная реакция между ферментом и продуктом возможна, то схема реакции будет иметь вид
|
|
|
|
|
|
|
|
k1 |
|
k2 |
|
|
|
|
|
|
|
|
|
|
|
|
|
|
||
|
|
|
|
|
|
E |
+ S →ES →E + P . |
|
|
|
|
|
|
|
||||||||||||
|
|
|
|
|
|
|
|
← |
|
← |
|
|
|
|
|
|
|
|
|
|
|
|
|
|
||
|
|
|
|
|
|
|
|
k−1 |
|
k−2 |
|
|
|
|
|
|
|
|
|
|
|
|
|
|
||
Скорость изменения концентрации ферментсубстратного комплекса |
||||||||||||||||||||||||||
d[ES] = k [E][S] −(k |
−1 |
+ k |
2 |
|
)[ES] + k |
−2 |
[E][P] . |
|
||||||||||||||||||
dt |
|
|
1 |
|
|
|
|
|
|
|
|
|
|
|
|
|
|
|
|
|
|
|
||||
|
|
|
|
|
|
|
|
|
|
|
|
|
|
|
|
|
|
|
|
|
|
|
|
|
||
При стационарных условиях |
|
|
|
|
|
|
|
|
|
|
|
|
|
|
|
|
|
|
|
|
||||||
|
|
|
|
|
|
|
|
|
d[ES] = 0 , |
|
|
|
|
|
|
|
|
|||||||||
|
|
|
|
|
|
|
|
|
|
dt |
|
|
|
|
|
|
|
|
|
|
|
|
|
|
||
следовательно |
|
|
|
|
|
|
|
|
|
|
|
|
|
|
|
|
|
|
|
|
|
|
|
|
|
|
k1[E][S] −(k−1 + k2 )[ES] + k−2[E][P] =0, |
|
|
||||||||||||||||||||||||
|
|
|
|
[ES] = |
k1[S] + k−2[P] |
[E]. |
|
|
|
|
|
|
|
|||||||||||||
|
|
|
|
|
|
|
|
|
|
|
|
|
|
|
|
|
|
|||||||||
|
|
|
|
|
|
|
|
|
k−1 + k2 |
|
|
|
|
|
|
|
|
|
|
|
||||||
Подставим в это уравнение выражение для [E] из уравнения |
||||||||||||||||||||||||||
материального баланса [E]0 =[E] +[ES] |
|
|
|
|
|
|
|
|
|
|
|
|
|
|
||||||||||||
|
|
|
|
|
|
[E] =[E]0 −[ES]. |
|
|
|
|
|
|
|
|
||||||||||||
Получим |
|
|
|
|
|
|
|
|
|
|
|
|
|
|
|
|
|
|
|
|
|
|
|
|
|
|
|
[ES] = |
k1[S] + k−2[P] |
([E]0 −[ES]) , |
|
|
|
|
|||||||||||||||||||
|
|
|
|
|
|
|
||||||||||||||||||||
|
|
|
|
|
|
|
k−1 + k2 |
|
|
|
|
|
|
|
|
|
|
|
|
|
|
|
|
|||
[ES] + |
k1[S] + k−2[P] |
[ES] = |
k1[S] + k−2[P] |
[E]0 , |
|
|||||||||||||||||||||
|
|
|
|
|
|
|||||||||||||||||||||
|
|
|
|
k−1 + k2 |
|
|
|
|
|
|
|
k−1 + k2 |
|
|
|
|
|
|||||||||
|
|
|
|
k1[S] + k−2[P] |
|
k1[S] + k−2[P] |
|
|
|
|
||||||||||||||||
|
|
|
|
|
|
|
|
|
||||||||||||||||||
[ES] 1 + |
|
|
|
|
|
|
|
= |
|
|
|
|
|
|
|
|
|
|
[E]0 , |
|
||||||
|
k−1 |
+ k2 |
|
|
|
|
k−1 + k2 |
|
|
|||||||||||||||||
|
|
|
|
|
|
|
|
|
|
|
|
|
|
|
||||||||||||
|
+ k2 + k1[S] + k−2 |
[P] |
|
|
|
k1[S] |
+ k−2 |
[P] |
|
|
||||||||||||||||
k−1 |
|
|
|
|
|
|||||||||||||||||||||
[ES] |
|
|
|
|
|
|
|
|
|
|
|
|
|
= |
|
|
|
|
|
|
|
|
|
[E]0 |
, |
|
|
|
|
k−1 + k2 |
|
|
|
|
|
|
k−1 |
+ k2 |
|
|
|||||||||||||
|
|
|
|
|
|
|
|
|
|
|
|
|
|
|
||||||||||||
|
[ES] = |
|
|
k1[S] + k−2[P] |
|
[E]0 . |
|
|
||||||||||||||||||
|
k−1 |
+ k2 + k1[S] + k−2[P] |
|
|
||||||||||||||||||||||
|
|
|
|
|
|
|
|
|
|
|
|
|||||||||||||||
Скорость изменения концентрации продукта
46
w = |
d[P] |
|
= k2[ES] − k−2[E][P] = k2[ES] − k−2 ([E]0 −[ES])[P] = |
|||||||||||||
dt |
||||||||||||||||
|
|
|
|
|
|
|
|
|
|
|
|
|
|
|||
=[ES](k2 + k−2[P]) − k−2[E]0[P] = |
|
|
|
|
||||||||||||
= |
|
(k1[S] + k−2[P])[E]0 |
(k2 + k−2[P]) |
− k−2[E]0[P] = |
||||||||||||
|
k−1 + k2 + k1[S] + k−2[P] |
|||||||||||||||
|
|
|
|
|
|
|||||||||||
|
|
|
(k1[S] + k−2[P])(k2 + k−2[P]) |
|
|
|
||||||||||
|
|
|
|
|
|
|||||||||||
= |
[E]0 |
|
|
|
|
|
|
|
|
|
− k−2 |
[P] |
= |
|||
k |
−1 |
+ k |
2 |
+ k |
[S] + k |
−2 |
[P] |
|
||||||||
|
|
|
|
|
1 |
|
|
|
|
|
|
|||||
=(k1k2[S] − k−1k−2[P])[E]0 . k−1 + k2 + k1[S] + k−2[P]
Вначальный момент времени, когда продукт в системе отсутствует
([P] = 0 )
w |
= |
|
k k |
2 |
[S][E] |
0 |
= |
k |
2 |
[S][E] |
0 |
|
= |
wS |
|
[S] |
, |
|||
|
1 |
|
|
|
|
|
|
max |
|
|
||||||||||
прямая |
|
k |
+ k |
+ k [S] |
|
k−1 + k2 |
+[S] |
|
K S |
+[S] |
|
|||||||||
|
|
|
−1 |
|
|
2 1 |
|
|
|
k |
|
M |
|
|
|
|
||||
|
|
|
|
|
|
|
|
|
1 |
|
|
|
|
|
|
|
|
|||
|
|
|
|
|
|
|
|
|
|
|
|
|
|
|
|
|
|
|
|
|
таким образом, уравнение принимает вид уравнения Михаэлиса. Если концентрация субстрата падает до нуля [S] = 0 , то
w |
= |
(−k |
−1 |
k |
−2 |
[P])[E] |
0 |
= |
− k |
−1 |
[P][E] |
0 |
|
= |
wP |
|
[P] |
|||||
|
|
|
|
|
|
|
|
|
|
max |
|
|||||||||||
обратная |
|
k |
−1 |
+ k |
2 |
+ k |
−2 |
[P] |
|
k−1 |
+ k2 |
+[P] |
|
K P |
+[P] |
|||||||
|
|
|
|
|||||||||||||||||||
|
|
|
|
|
|
|
|
|
|
|
|
|
|
M |
|
|
||||||
|
|
|
|
|
|
|
|
|
|
k |
−2 |
|
|
|
||||||||
|
|
|
|
|
|
|
|
|
|
|
|
|
|
|
|
|
|
|
|
|||
и уравнение принимает вид уравнения Михаэлиса по отношению к продукту для обратной реакции.
Эти предельные случаи очень важны.
Во-первых, если ферментативная реакция действительно обратима, то обратная реакция также является каталитической, и если в начале реакции в системе находится фермент и продукт, для обратной реакции wmax и KMP определяются так же просто, как если бы измерялась скорость прямой каталитической реакции.
Во-вторых, осложнения, обусловливаемые наличием обратной реакции, как правило, можно обойти, просто ограничивая измерения экспериментами,в которых [P]0≈ .
Скорость образования продукта w обратимой ферментативной реакции уменьшается по двум причинам.
47
Во-первых, некоторое количество продукта в результате обратной реакции превращается обратно в субстрат – вычитаемое k−1k−2[P] в числителе выражения
w = (k1k2[S] − k−1k−2[P])[E]0 . k−1 + k2 + k1[S] + k−2[P]
Во-вторых, увеличивается доля фермента, связанного в комплексе EP с продуктом, который не может взаимодействовать с субстратом –
слагаемое k−2[P] в знаменателе. |
|
|
|
|
||||
Таким |
образом, |
обратимая |
ферментативная |
реакция |
||||
k1 |
k2 |
|
|
|
(k1k2[S] − k−1k−2[P])[E]0 |
|
||
E + S →ES →E + P , описываемая уравнением |
w = |
, |
||||||
|
||||||||
← |
← |
|
|
|
k−1 + k2 + k1[S] + k−2[P] |
|||
k−1 |
k−2 |
|
|
|
||||
служит примером простой биологической регуляции на молекулярном уровне:
продукт образуется быстро,только если его мало,
продукт образуется медленнее, если концентрация] [P велика.
|
|
ВОПРОСЫ ДЛЯ САМОКОНТРОЛЯ |
1. |
Запишите выражение для скорости образования продукта реакции |
|
|
k1 |
k2 |
|
E + S →ES →E + P . |
|
|
← |
← |
|
k−1 |
k−2 |
2. |
Проанализируйте предельные случаи [P] = 0 и [S] =0 для |
|
обратимой ферментативной реакции.
3.Назовите две причины, по которым уменьшается скорость образования продукта обратимой ферментативной реакции.
21.СНЯТИЕ ОГРАНИЧЕНИЙ МИХАЭЛИСА-МЕНТЕН:
2.РЕАКЦИИ С ЧИСЛОМ ПРОМЕЖУТОЧНЫХ СОЕДИНЕНИЙ БОЛЬШЕ ОДНОГО
Будем считать теперь, что природа фермент субстратного комплекса изменяется в ходе протекания реакции
48
|
|
|
|
k1 |
|
k3 |
k2 |
|
|
|
|
|
E + S→ES→EP →E + P . |
||||
|
|
|
|
← |
|
← |
|
|
|
|
|
|
k−1 |
|
k−3 |
|
|
При стационарных условиях |
|
|
|
|
||||
|
|
|
|
[ES] = const , [EP] = const |
||||
кинетические уравнения будут иметь вид |
|
|||||||
d[ES] |
= k [E][S] + k [EP] −(k + k )[ES] = 0 |
|||||||
|
dt |
|
|
1 |
|
−3 |
|
−1 3 |
|
|
|
|
|
|
|
|
|
d[EP] |
= k3[ES] − |
(k−3 + k2 )[EP] =0 |
||||||
|
dt |
|
||||||
|
d[P] |
|
|
|
|
|
||
|
|
= k2[EP]. |
|
|
|
|||
w = |
dt |
|
|
|
||||
|
|
|
|
|
|
|
||
Уравнение материального баланса
[E]0 =[E] +[ES] +[EP]. Отсюда [E] =[E]0 −[ES] −[EP] .
Подставляем в первое уравнение системы
0= k1[E][S] + k−3[EP] − (k−1 + k3 )[ES] =
= k1([E]0 −[ES] −[EP])[S] + k−3[EP] − (k−1 + k3 )[ES].
Далее
(k−1 + k3 )[ES] + k1[ES][S] = k1[E]0[S] − k1[EP][S] + k−3[EP],
|
|
[ES] = |
k1[E]0[S] − k1[EP][S] + k−3[EP] |
. |
|
|
|
||||
|
|
|
|
|
|
|
|||||
|
|
|
|
k−1 + k3 + k1[S] |
|
|
|
||||
|
Подставляем это выражение во второе уравнение системы |
|
|||||||||
|
|
d[EP] = k3[ES] −(k−3 + k2 )[EP] = 0, |
|
|
|
||||||
|
|
dt |
|
|
|
|
|
|
|
|
|
|
k3 |
k1[E]0[S] − k1[EP][S] + k−3 |
[EP] |
− (k−3 + k2 )[EP] = 0 |
|
||||||
|
k−1 + k3 + k1[S] |
|
|
|
|||||||
|
|
|
|
|
|
|
|
|
|||
и решаем его относительно [EP] . Выражение |
|
|
|
|
|
||||||
|
k3 (k1[E]0[S] − k1[EP][S] + k−3 |
[EP]) −(k−1 + k3 + k1[S])(k−3 |
+ k2 )[EP] |
=0 |
|||||||
|
|
|
k−1 + k3 + k1[S] |
|
|
|
|
||||
|
|
|
|
|
|
|
|
||||
выполняется, если числитель равен нулю. |
|
|
|
|
|
||||||
|
k3 k1[E]0 [S] − k3 k1[EP][S] + k3 k−3 [EP] − |
|
|
|
|||||||
|
− (k−1k−3 + k−1k2 + k3 k−3 |
+ k3k2 + k1k−3 [S] + k1k2 [S])[EP] = 0 |
|
||||||||
|
|
|
|
49 |
|
|
|
|
|
|
|