Материал: Ферменты
Рисунок 4 –Схема бисубстратной ферментативной реакции: 1 |
–свободный |
фермент Е; 2 –комплекс Е·А; 3 – Комплекс Е·А·В; 4 –Переходное |
состояние Е≠; |
5 –Комплекс Е·С·D; 6 –комплекс E·D |
|
В реакциях с образованием тройного комплекса все субстраты должны быть сорбированы на ферменте, прежде чем, какой либо продукт реакции будет десорбирован. Так, в бисубстратной реакции образуется тройной комплекс: фермент и оба субстрата.
Реакции с образованием тройного комплекса бывают двух типов:
1)упорядоченные, в которых субстраты сорбируются на ферменте в строго определенном порядке,
2)неупорядоченные (статистические), в которых порядок присоединения субстратов к ферменту произволен.
Например, многие ферменты, использующие NAD+ или NADH в качестве субстратов, демонстрируют упорядоченный механизм. Рассмотренный в разделе "Механизмы ферментативных процессов" [1] пример каталитического цикла лактатдегидрогеназы представляет собой характерный пример такого рода реакции. Лактатдегидрогеназа восстанавливает пируват в лактат, окисляя при этом NADH в NAD+ (рисунок 5).
10
Пируват |
Лактат |
Рисунок 5 – Схемареакции восстановленияпирувата |
в лактат |
В упорядоченных реакциях последовательного замещения кофермент
NADH всегда присоединяется первым, а лактат всегда десорбирует первым. Эта последовательность схематически изображена на рисунке 6 в виде,предложенном Клеландом.
NADH Пируват |
Лактат NAD+ |
Фермент 
Фермент Фермент-NADH-Пируват Фермент-Лактат-NAD+
Рисунок 6 –Схема |
Клеланда упорядоченной каталитической бисубстратной |
реакциивосстановленияпирувата |
в лактат на лактатдегидрогеназе |
Фермент-субстратный комплекс представляет собой тройной комплекс: сначала он состоит из фермента и субстратов, а затем из фермента и продуктов.
Встатистических( неупорядоченных) реакциях порядок, в
котором субстраты присоединяются к ферменту произволен. Например, креатинкиназа образует фосфокреатин и АДФ из креатина и АТФ (рисунок 7).
Схема Клеланда этой реакции изображена на рисунке 8.
В"пинг-понг" реакциях один или более продуктов реакции десорбирует еще до того момента, когда все субстраты присоединятся к ферменту. Определяющей особенностью этого механизма является
существование промежуточного состояния фермента, в котором молекула фермента временно модифицирована.
11
Креатин Фосфокреатин
Рисунок 7 – Схемаобразованияфосфокреатинаизкреатина |
с участиемАТФ |
Классическим примером такого механизма является реакция, в которой аминогруппа переносится между аминокислотой и α-кетокислотой (рисунок 9).
|
|
АТФ |
Креатин |
Фосфокреатин |
АДФ |
|||||||||||
Фермент |
|
|
|
|
|
|
|
|
|
|
|
|
|
|
|
Фермент |
|
|
|
|
|
|
|
|
|
|
|
|
|
|
|
||
|
|
|
|
|
|
|
|
|
|
|
|
|
|
|
||
|
|
|
|
|
|
Е-АТФ- Е-АДФ- |
|
|
|
|
|
|||||
|
|
|
|
|
|
|
|
|
|
|
|
|
|
|
||
|
|
|
|
|
|
|
|
|
|
|
|
|
|
|
||
|
|
|
|
|
|
-Креатин |
-Фосфокреатин |
|
|
|
|
|
|
|||
|
|
|
|
|
|
|
|
|
|
|
||||||
Креатин |
АТФ |
|
АДФ |
Фосфокреатин |
||||||||||||
Рисунок 8 |
–Схема |
|
|
Клеланда |
статистической |
каталитической бисубстратной |
||||||||||
реакцииобразованияфосфокреатина |
|
|
|
|
|
|
|
|
|
|||||||
Фермент |
|
аспартатаминотрансфераза |
|
катализирует перенос |
||||||||||||
аминогруппы от аспартата к α-кетоглютарату.
аспартат α-кетоглютарат глютамат оксалоацетат
Рисунок 9 – Схема реакции переноса аминогруппы между аспартатом и α-кето- глютаратом
Схема Клеланда этой реакции представлена на рисунке 10.
аспартат |
оксалоацетат |
α-кетоглютарат глютамат |
Фермент 
Фермент
Е(Е-NH3) (Е-NH3) (Е-NH3) E
(аспартат) (оксалоацетат) |
(α-кетоглютарат) (глютамат) |
Рисунок 10 – Схема Клеланда каталитической бисубстратной реакции типа "пинг-
понг"
После сорбции аспартата фермент присоединяет к себе аминогруппу, образуя временную модифицированную форму. После этого первый продукт,оксалоацетат,десорбирует.
Второй субстрат, α-кетоглютарат, сорбируется на модифицированном ферменте, присоединяет аминогруппу и продукт, глютамат, десорбирует с фермента.
Фермент работает как своего рода почтовый ящик, в котором первый субстрат (почтальон) оставил функциональную группу (почту), а второй субстрат (клиент) ее забрал. Пустой почтовый ящик –это фермент, а ящик с почтой– временная модифицированная форма этого фермента.
Субстраты сорбируют и десорбируют на ферменте как мячики настольного тенниса ударяются об игровой стол, поэтому такой механизм получил название "пинг-понг"-механизм.
ВОПРОСЫ ДЛЯ САМОКОНТРОЛЯ
1.Какие ферментативные реакции называются мультисубстратными?
2.Какой "тройной комплекс" образуется в мультисубстратных реакциях с образованием тройного комплекса?
3.В чем отличие реакций типа "пинг-понг" от реакций с образованием тройного комплекса?
4.Какие схемы называются схемами Клеланда?
12 |
13 |
4. РЕГУЛЯЦИЯ ФЕРМЕНТАТИВНОЙ АКТИВНОСТИ
Способность к регуляции отличает биокатализаторы от химических катализаторов.
Одним из удивительных свойств живых организмов является сохранение постоянного баланса между необходимыми для поддержания жизнедеятельности различными биодеградативными процессами и огромным количеством биосинтетических процессов.
Клеточный гомеостаз достигается благодаря функционированию эффективной и сложной системы регуляции, приводящей каждый отдельный метаболический процесс в строгое соответствие с нуждами организма в целом.
Поскольку практически все клеточные реакции катализируются ферментами, координация метаболизма в существенной мере сводится к регуляции интенсивности протекания ферментативных реакций,
образующих метаболические пути.
Эффективность биологического катализа в клетке может регулироваться двумя путями:
1)путем изменения количества катализатора,
2)путем регулирования активности фермента.
Количество фермента в клетке определяется соотношением скоростей его синтеза и распада.
Скорость синтеза данного фермента может сильно меняться в зависимости от условий.
Существуют ферменты, которые всегда присутствуют в клетке в более или менее постоянных количествах: их называют конститутивные ферменты. В отличие от них так называемые адаптивные (или индуцибельные) ферменты синтезируются только в ответ на появление в среде соответствующего субстрата.
Гены, контролирующие синтез адаптивных ферментов, обычно находятся в состоянии репрессии и вводятся в действие только в присутствии индуктора.
Механизмы регуляции ферментативной активности на уровне синтеза ферментов являются достаточно медленными; для их реализации нужны по меньшей мере часы.
Существуют относительно быстрые регуляторные механизмы, которые направлены непосредственно на ферменты.
Многие соединения могут влиять на обмен веществ, модулируя активность соответствующих ферментов.
Особенно важные функции при этом выполняют ингибиторы ферментов. (Ингибиторами ферментов являются многие лекарственные вещества природного или синтетического происхождения.)
Метаболиты (промежуточные продукты метаболических путей) также могут быть ингибиторами ферментов в процессах регуляции.
ВОПРОСЫ ДЛЯ САМОКОНТРОЛЯ
1.Назовите два пути регуляции эффективности биокатализа.
2.Чем отличаются конститутивные и адаптивные ферменты?
3.В чем отличие генного и ингибиторного механизмов регуляции ферментативной активности?
5. ТИПЫ ИНГИБИРОВАНИЯ ФЕРМЕНТОВ
Ингибиторы разделяют на обратимые и необратимые.
Обратимые ингибиторы не вносят в молекулу фермента каких-либо изменений после своей диссоциации.
Необратимые ингибиторы необратимо модифицируют целевой фермент.
Различают конкурентное, неконкурентное и бесконкурентное
ингибирование.
Схема ферментсубстратного комплекса в отсутствии ингибирования представлена в Таблице 1 (1).
Конкурентным называется ингибирование, при котором молекула ингибитора подобна молекуле субстрата (аналог субстрата) (Таблица 1 (2)). Она блокирует активный центр фермента и полностью
14 |
15 |
предотвращает связывание фермента с субстратом. Субстрат и фермент конкурируют за место связывания на ферменте.
Таблица 1 –Схемы ингибирования
Тип регуляции |
Схема ферментсубстратного |
|
комплекса |
||
|
1В отсутствии ингибирования
2Конкурентное
ингибирование
3Аналог переходного состояния
4Неконкурентное
ингибирование
5Суицидные
субстраты
6Аллостерическое
ингибирование
Аналоги переходного состояния (Таблица 1 (3)) также действуют как конкурентные ингибиторы.
Например (рисунок |
11),малоновая (1),щавелево -уксусная (2)и |
глутаровая (3)кислоты |
ингибируют фермент сукцинатдегидрогеназу, |
|
16 |
субстратом которой является янтарная кислота(4)сукцинат( |
), так как они |
сходны по строению с субстратом. |
|
Рисунок 11 – |
Схемы строения: 1 –малоновой |
; 2 – щавелево-уксусной; |
3 –глутаровойи4 –янтарной |
(сукцинат) кислот |
|
Другой пример, сульфаниламидные антибактериальные препараты (рисунок 12(1)) имеют сходное строение с парааминобензойной кислотой (рисунок 12(2)) и являются конкурентными ингибиторами в синтезе бактериями фолиевой кислоты (фактора роста бактерий).
Рисунок 12 – Схемы строения: 1 –сульфаниламидных |
антибактериальных препа- |
ратов; 2 –парааминобензойной кислоты |
|
У человека нет такого метаболического пути и в лечебных дозах они не влияют на жизнедеятельность человека, оказывая общий бактериостатический эффект (нарушая в некоторой степени деятельность кишечной микрофлоры).
17
Неконкурентным называется ингибирование, при котором связывание фермента с ингибитором не влияет на связывание фермента с субстратом, но ингибитор модифицирует функционально важную каталитическую группу фермента "отключая" фермент. Структура активного центра изменяется и каталитическое превращение не происходит
(Таблица 1 (4)).
Неконкурентные ингибиторы, поскольку они модифицируют функциональные группы целевого фермента, действуют как правило необратимо.
В случае так называемых "суицидных субстратов" речь идет о субстратных аналогах, содержащих дополнительно реакционную группу (Таблица 1 (5)). Вначале они связываются обратимо, а затем образуют ковалентное соединение с активным центром фермента. Поэтому ингибирование такими соединениями проявляется как неконкурентное. Известным примером такого ингибитора является антибиотик пенициллин.
Бесконкурентным называется ингибирование, которое возникает, когда ингибитор может связываться с ферментом только в виде его комплекса с субстратом.
Кинетическая схема ингибирования выглядит следующим образом
|
|
|
|
E |
KS |
ES → E + P |
|
|
|
|
|
↔ |
|||
|
|
|
KI |
7 |
|
7 KI′ |
, |
|
|
|
|
EI |
↔ EIS |
|
|
|
|
|
|
|
αKS |
|
|
где |
KI = [E][I ] |
–константа |
диссоциации |
комплекса EI , ( EI ↔ E + I ), |
|||
|
|
[EI ] |
|
|
|
|
|
KS |
= |
[E][S] – константа диссоциации комплекса ES , ( ES ↔ E + S ). |
|||||
|
|
[ES] |
|
|
|
|
|
|
|
Для конкурентного ингибирования α = ∞: |
|||||
|
|
|
|
E |
KS |
ES →E + P |
|
|
|
|
|
↔ |
|||
|
|
|
K I |
7 |
|
|
. |
|
|
|
|
EI |
|
|
|
18
Для неконкурентного ингибирования α =1:
E |
KS |
→E + P |
↔ ES |
||
K I 7 |
|
. |
EI |
↔ EIS |
|
|
KS |
|
Для бесконкурентного ингибирования KI =∞:
KS |
→ → E + P |
|
E ↔ ES |
|
|
7 K I′ |
. |
|
EIS |
|
|
И,наконец,существует аллостерическое ингибирование.
Аллостерические ингибиторы связываются с отдельными участками фермента вне активного центра. Такое связывание влечет за собой
конформационные изменения в молекуле фермента, которые приводят к уменьшению его активности (Таблица 1 (6)).
Аллостерические эффекты встречаются практически только в случае олигомерных ферментов.
Аллостерические эффекты могут заключатся как в ингибировании, так и в активации фермента, поэтому аллостерическое ингибирование – это частный случай аллостерического механизма регуляции.
ВОПРОСЫ ДЛЯ САМОКОНТРОЛЯ
1.В чем отличие обратимого и необратимого ингибирования?
2.В чем отличие конкурентного и неконкурентного ингибирования?
3.Какие субстраты называются суицидными?
4.В чем специфика аллостерического ингибирования?
5.Запишите обобщенную кинетическую схему ингибирования.
6. АЛЛОСТЕРИЧЕСКИЙ МЕХАНИЗМ РЕГУЛЯЦИИ АКТИВНОСТИ ФЕРМЕНТОВ
Аллостерическим механизмом регуляции активности ферментов
называют регуляторный механизм, в котором контроль активности
19