Материал: Биохимия учебное пособие

Поэтомуданный этап необратим, за исключениемсобственно обратимых реакций. Необходимость ковалентных превращений делает этап II самой медленной стадией, лимитирующей скорость всего ферментативного процесса.

Этап III – десорбция готового продукта реакции (Р) из комплекса E–S*, которая сопровождается освобождением фермента в его исходном виде. Этот этап, как и этап II, является необратимым (за исключением катализа обратимых реакций).

1.7.Основыкинетикиферментативныхреакций

Кинетика изучает влияние различных факторов на скорость реакции. Общие принципы кинетики химических реакций применимы и к ферментативным реакциям. Скорость ферментативной реакции измеряют по убыли субстрата или прироступродуктареакциизаединицувремени.Принятоизмерятьначальнуюскорость реакции, чтобы свести кминимумувлияниетакихфакторов, как уменьшениеконцентрации субстрата, обратимость реакции, образованиепродуктов, тормозящих реакцию. В качестве единиц скорости реакции используют моль/с или мкмоль/мин.

Интервалвремени, в течениекоторогоскоростьреакции равна начальной скорости или близка к ней, соответствует прямолинейному участку графика зависимости скорости реакции от времени (рис. 5).

Время

Рис. 5. Зависимость скоростиферментативной реакции от времени. Начальнаяскорость ( 0)увеличивается пропорционально концентрациифермента (Е)

Эксперименты in vitro позволяют исследовать ферментативную реакцию, варьируя тот или иной параметр при соблюдении постоянства остальных.

15

1.7.1. Зависимость скоростиреакцииот концентрациифермента

Зависимость скорости реакции от концентрации фермента изучают, варьируя количество фермента при достаточно высокой концентрации субстрата. В этих условиях скорость реакции в интервале времени, соответствующем начальной скорости реакции, прямопропорциональна концентрации фермента в реакционной смеси (рис. 6).

[Е]

Рис. 6. Зависимость скоростиферментативной реакцииот концентрациифермента [E] при достаточновысокой концентрации субстрата

Разделив скорость реакции, измеренную на линейном участке, на концентрацию фермента в реакционной смеси, получают параметр – активность фермента. Активность фермента – это скорость ферментативной реакции, отнесенная к концентрации фермента. Посути, это–тангенс угла наклона линейногоучастка к оси абсцисс.Ферментымогутнаходитьсявразномфункциональномсостоянии,поэтому параметры «активность фермента» и «количество фермента» могут не совпадать. Активность фермента характеризует не количество, а эффективность фермента.

Для оценки количества фермента Международная система единиц (СИ) рекомендует единицу «катал». Катал – это такое количество фермента, которое преобразует 1 моль субстрата за 1 с.

Для биологическихобъектов даннаяединица измерения чрезмерновелика, поэтомуиспользуют единицунанокатал. Обычно применяют более удобную международную единицу (МЕ). МЕ – это количество фермента, которое преобразует 1 мкмоль субстрата за 1 мин.

1.7.2. Влияниеконцентрациисубстратанаскорость реакции

Влияние концентрации субстрата можно исследовать путем измерения скорости реакции в серии пробспостоянной концентрацией фермента, новозрастающей концентрацией субстрата.

16

График зависимости скорости ферментативной реакции ( ) от концентрации субстрата при фиксированной концентрации фермента представляет собой гиперболу (рис. 7).

max

12 max

12 max

Рис. 7. Зависимость скоростиреакции ферментативной реакции от концентрации субстрата при постоянной концентрации фермента

Вначале скорость реакции прямо пропорциональна концентрации субстрата, при ее дальнейшем увеличении скорость реакции постепенно достигает максимального значения. Это означает, что все связывающие участки фермента заняты (насыщены). Скорость реакции на этом участке не зависит от концентрации субстрата. Такую кривую называют кривой субстратного насыщения.

Уравнение, описывающее кривую субстратного насыщения, было предложено Михаэлисом и Ментен и носит их имена (уравнениеМихаэлиса – Ментен):

max [S],

KM [S]

где [S] – концентрация субстрата;

–скоростьреакции при данной концентрации субстрата; KМ – константа Михаэлиса.

max и KМ – главные кинетические константы, характеризующие фермент в его реакции с данным субстратом.

Легко рассчитать, если = 1/2 max, то KМ = [S], т. е. KМ – это концентрация субстрата, при которой скорость реакции составляет 1/2 max. КонстантуМихаэлиса можно вычислить по графику. Отрезок на абсциссе, соответствующий скорости, равной половине максимальной, представляет собой KМ.

17

max – максимальная скорость данной ферментативной реакции, т. е. предельное значение, к которому стремится скорость реакции при бесконечно большом увеличении концентрации субстрата.

С целью упрощения определения величины max и KМ уравнение Михаэлиса – Ментен можнолинеаризовать:

1/ = KМ + [S]/ max [S],

1/ = KМ/ max [S] + 1/ max.

1/ = KМ/ max 1/[S] + 1/ max – уравнение Лайнуивера – Берка.

Уравнение, описывающее графикЛайнуивера –Берка, –этоуравнениепрямой

линии y = kx + b, где 1/ max – это отрезок, отсекаемый прямой на оси ординат; KМ/ max – тангенс угла наклона прямой; пересечение прямой с осью абсцисс дает

величину1/KМ (рис. 8). ГрафикЛайнуивера– Берка позволяетопределитьKМ поотносительно небольшому числу точек. Этот график также используют при оценке действияингибиторов.

1

tg KM

max

Рис. 8. ГрафикЛайнуивера – Берка

Значения KМ изменяются в широких пределах:от 10–6 моль/лдля очень активных ферментов до 10–2 моль/л для малоактивных ферментов. Оценки KМ имеют практическое значение. При концентрациях субстрата, в 100 раз превышающих KМ, ферментбудет работатьпрактически смаксимальной эффективностью, поэтому max будет отражать количество присутствующего активного фермента. Это обстоятельство используют для оценки содержания фермента в препарате. Кроме того, KМ является характеристикой фермента.

18

1.7.3. Зависимость скоростиферментативнойреакции от температуры

Ферменты, вещества белковой природы, проявляютмаксимальнуюактивность в ограниченном температурном интервале (рис. 9). При температурах до 40–50 °С скорость реакции увеличивается согласно теории химической кинетики, т. е. в соответствии с правилом Вант-Гоффа возрастает примерно в 2 раза. При более высоких температурах тепловая денатурация приводит к уменьшению количества активногофермента и вконечномитоге–кполномупрекращениюферментативной реакции. Термолабильностьотличаетферментыотнеорганическихкатализаторов.

Рис. 9. Зависимостьскоростиферментативной реакции( ) от температуры среды

1.7.4. Зависимость скоростиферментативной реакцииот рН

Оптимум рН действия большинства ферментов лежит в пределах физиологических значений 6,0–8,0. Пепсин активен при рН 1,5–2,0, что соответствует кислотности желудочного сока. Аргиназа, специфический фермент печени, активен при 10,0. Влияние рН среды на скорость ферментативной реакции связывают с состоянием и степенью ионизации ионогенных групп в молекуле фермента и субстрата (рис. 10). Этотфакторопределяетконформациюбелка, состояниеактивного центра и субстрата, формирование фермент-субстратного комплекса, собственно процесс катализа.

19