Материал: vse_metody_MIKROB

Механизм реакции: при взаимодействии антител гемолитической сыворотки с эритроцитами барана (Аг) образуется иммунный комплекс [Аг+Ат] к которому присоединяется комплемент. В результате происходит лизис эритроцитов (гемолиз).

Реакция иммуногемолиза не имеет самостоятельного значения, т.к. все компоненты в ней известны, но используется в качестве индикаторной системы в реакции связывания комплемента.

Реакция связывания комплемента (РСК) – сложная трехкомпонентная реакция. Компоненты: исследуемая сыворотка пациента; диагностикум; комплемент. Индикаторная (гемолитическая) система – гемолитическая сыворотка + эритроциты барана.

Постановка реакции (рис.6): в опытную пробирку помещают исследуемую сыворотку пациента (Ат), диагностикум (известный Аг) и комплемент; оставляют пробирку на 1 час в термостате (370С) для контакта. В другой пробирке готовят индикаторную систему (гемолитическая сыворотка + взвесь эритроцитов барана). Через 1 час инкубации в опытную пробирку добавляют индикаторную систему. Учет реакции производят через 16-18 часов.

а)

б)

Рисунок 6 – Схема положительной (а) и отрицательной (б) РСК

10

Механизм: при положительной реакции в сыворотке больного присутствуют антитела, образуется комплекс Аг+Ати комплемент адсорбируется на этом комплексе. Поэтому, когда в пробирку добавляют индикаторную (гемолитическую) систему, в отсутствии комплемента не происходит реакции иммуногемолиза, и эритроциты выпадают в осадок. При отрицательной реакции (отсутствие соответствующих антител в сыворотке обследуемого) не образуется комплекс [Аг+Ат], поэтому комплемент остается свободным и связывается с гемолитической системой, что приводит к гемолизу (лизису эритроцитов). РСК используется для диагностики бактериальных (сифилис) и вирусных инфекций.

Реакция иммунофлюоресценции (РИФ) прямая (рис.7): двухкомпонент-

ная сложная серологическая реакция. Компоненты: диагностическая антимикробная сыворотка (Ат), меченная флюорохромом (изотиоцианат флюоресцеина); исследуемый антиген (бактерии или клетки организма, пораженные виру-

сами) – Аг. Индикатором реакции является флюорохром (*), который светится в УФ-лучах.

Рисунок 7 – Схема реакции иммунофлюоресценции (прямой метод)

Постановка реакции: на фиксированный мазок материала, в котором находится возбудитель (Аг), наносят люминесцирующую диагностическую сыворотку на 10-15 минут, затем сыворотку сливают, препарат промывают водой и микроскопируют в люминесцентном микроскопе. Если исследуемый антиген соответствует антителам сыворотки, они адсорбируются на его поверхности, и наблюдается яркое зеленое свечение клеток возбудителя или клеток, пораженных микроорганизмом. РИФ используется для экспресс-диагностики холеры, сибирской язвы, вирусных инфекций.

Реакция иммунофлюоресценции (РИФ) непрямая (рис.8): трехкомпо-

нентная сложная серологическая реакция. Компоненты: диагностическая антимикробная сыворотка (Ат), полученная путем иммунизации кроликов конкретным антигеном; исследуемый антиген (бактерии или клетки, пораженные вирусом) – Аг; антиглобулиновая (антикроличья) сыворотка (АГС), меченная флюорохромом. Содержит антитела против кроличьих иммуноглобулинов. Индика-

тором реакции является флюорохром (*).

Рисунок 8 – Схема реакции иммунофлюоресценции (непрямой метод)

11

Постановка реакции: на фиксированный мазок из исследуемого материала наносят диагностическую антимикробную сыворотку на 10-15 минут. Затем сыворотку сливают, препарат промывают водой и наносят антиглобулиновую (антикроличью) сыворотку, меченную флюорохромом, и повторно промывают. При положительной реакции (если в мазке есть возбудитель) образуется комплекс микроб + антимикробные (кроличьи) антитела + антикроличьи антитела, меченные флюорохромом. При микроскопии в люминесцентном микроскопе наблюдается яркое зеленое свечение клеток возбудителя или клеток, пораженных микроорганизмом. Реакция используется для экспресс-диагностики бактериальных и вирусных инфекций.

Иммуноферментный анализ (ИФА): сложная трехкомпонентная серологическая реакция, используется как для определения исследуемого антигена, так и для определения антител в сыворотке больного.

Компоненты реакции для определения антител в сыворотке больного: известный антиген (диагностикум), сорбированный на твердом носителе (в лунках пластин из полистирола); сыворотка больного (Ат); антиглобулиновая сыворотка против Ig человека, меченная ферментом. Индикатором реакции для визуального наблюдения является пероксидаза – фермент, который действует на субстрат (Н2О2), соединенный с хромогеном.

Техника постановки реакции: в лунки полистироловых пластин с сорбированным диагностикумом последовательно добавляют сыворотку больного, антиглобулиновую сыворотку, меченную ферментом, а затем субстрат (H2O2) с хромогеном. Каждый раз после добавления очередного компонента реакции, лунки пластин промывают для удаления не связавшихся реагентов.

При положительной реакции (наличие антител к данному антигену) образуется комплекс [Аг+Ат], к которому присоединяется антиглобулиновая сыворотка, меченная ферментом. Фермент пероксидаза расщепляет субстрат (перекись водорода), и среда в лунках окрашивается в желто-коричневый цвет за счет хромогена. Интенсивность окраски зависит от количества антигенов и антител, вступивших в реакцию. Реакция используется для диагностики вирусных гепатитов, ВИЧ-инфекции и др.

Практическая работа

1. Постановка и учет РА.

Постановка и учѐт РА на предметном стекле.

На чистое обезжиренное предметное стекло наносят с помощью пипетки каплю агглютинирующей коли-сыворотки и рядом (другой пипеткой) – каплю физиологического раствора. Затем в каплю физ. раствора (контроль антигена) и в каплю агглютинирующей сыворотки стерильной петлѐй вносят исследуемую культуру E.coli, снятую с поверхности скошенного МПА. Внесѐнную культуру тщательно перемешивают петлѐй, чтобы капля жидкости сделалась равномерно

12

мутной. Чтобы ускорить наступление реакции агглютинации, предметное стекло слегка покачивают. При положительной реакции в капле с сывороткой наблюдается образование взвешенных хлопьев и просветление жидкости. В контрольной капле – равномерное помутнение (рис.9).

Рисунок 9 – Схема постановки и учет реакции агглютинации на предметном стекле.

Постановка и учѐт развѐрнутой РА (на примере реакции Райта с бруцел-

лѐзным диагностикумом). Для постановки реакции используют следующие ингредиенты: 1) физ. раствор; 2) сыворотка крови обследуемого; 3) бруцеллѐзный диагностикум. Постановка реакции (табл.3): в штативе устанавливают 7 пробирок. Во все пробирки, за исключением первой и предпоследней (контроль сыворотки), наливают градуированной стерильной пипеткой по 1 мл физ. раствора. Затем из пробирки с основным разведением сыворотки 1/50 берут 3 мл и наливают по 1 мл в 1-ю, 2-ю и в предпоследнюю пробирку.

После этого готовят разведения сыворотки. Для этого 1 мл содержимого 2- ой пробирки переносят в 3-ю, из 3-й пробирки такое же количество в 4-ю, из 4- ой в 5-ю. Из 5-ой пробирки (последней опытной) для сохранения одинакового объѐма (1 мл) во всех пробирках 1 мл содержимого вместе с пипеткой помещают в дезинфицирующий раствор.

Таким образом, разведение сыворотки в первой пробирке соответствует основному еѐ разведению (1/50), а в последующих пробирках получается ряд последовательных двукратных разведений 1:100, 1:200, 1:400, 1:800. Затем во все пробирки, за исключением контроля сыворотки (КС), вносят по 2 капли бруцеллѐзного диагностикума. Последняя пробирка является контролем антигена (КА). Штатив с пробирками встряхивают, ставят на 2 часа в термостат при 37оС, а затем на 18-20 часов при комнатной температуре.

Учѐт результатов реакции начинают с контролей. Реакция может учитываться дальше лишь в том случае, если в пробирках с контролями жидкость остаѐтся совершенно однородной: в контроле антигена – слегка мутной, в контроле сыворотки – прозрачной.

13