Дипломная (вкр): Влияние молекулярного кислорода на спектрально-оптические свойства окрашенных растворов гемоглобина в пористой среде

Рисунок 6 - Модель диффузии в структурированной среде (белке)

При раскрытии флуктуационной щели на величину х>x₀ субстрат 1 может диффундировать сквозь щель. Диффузия субстрата 2 сильно затруднена, так как требуется большая деформация щели (большая энергия активации).

Рисунок 6 иллюстрирует общую схему процесса диффузии через флуктуирующую щель, образованную элементами структуры белковой глобулы. Суть состоит в том, что для акта диффузии необходимо, чтобы просвет во флуктуирующей щели был не меньше, чем ванн-дер-ваальсов размер лиганда. Энергия активации диффузии при этом будет определяться соответствующей энергией раскрытия щели. В жидкостях на форму флуктуационной полости или дырки практически не накладывается существенных ограничений. В белковой глобуле это не так. Здесь имеется относительно жесткий упругий каркас, образованный спиральными элементами структуры. Подвижные боковые группы обеспечивают формирование дырки для диффузионного проникновения лиганда. Но форма этой дырки или щели диктуется локальной геометрией белковой структуры. В твердых телах геометрические ограничения еще более жесткие, но в этом случае в отличие от белка нет подвижных боковых групп, обеспечивающих раскрытие щелей с приемлемой энергией активации. Таким образом, белковая глобула представляет собой структурированную среду, в которой подвижная часть похожа на вязкую жидкость, но возможные формы флуктуационных полостей и щелей ограничены упругим каркасом [19]. Проникновение внутрь белковой глобулы молекул (лигандов), геометрия которых не соответствует этим формам, будет сильно затруднено, так как потребует более широкого раскрытия щелей и соответственно значительно большей энергии активации. На этом этапе с точки зрения физики и закладываются основы стереоспецифичности биохимических процессов.

1.3 Пористая структура - силикагель

Силикагель - высушенный гель кремневой кислоты пористого строения с сильно развитой внутренней поверхностью. Эта особенность обуславливает ценнейшие свойства силикагеля - адсорбента, носителя каталитически активного вещества и катализатора.

Получается при подкислении растворов силикатов щелочных металлов с последующей промывкой и высушиванием образовавшегося геля:

Na₂SiO₃ + 2HCl → 2NaCl + H₂SiO₃↓,

H₂SiO₃ → SiO₂ + H₂O.

Существуют несколько способов получения силикагеля. Силикагель получают взаимодействием силиката натрия с кислотой, щелочного силиката с солью аммония из концентрированных золей коллоидного кремнезема; разбавлением растворов при низких значениях pH и температурах ниже комнатной; гидролизом соединений кремния (хлорид кремния, ортокремниевые эфиры).

Силикагель имеет огромную площадь поверхности (800 м²/1 г), состоящую из групп - SiOH, расположенных на расстоянии 0,5 нм друг от друга. Эти группы являются активными центрами, причем активность конкретной партии силикагеля зависит от числа и активности таких центров. В активном адсорбенте, то есть таком, из которого адалена адсорбированная на его поверхности вода, многие центры будут активны. Такая активация происходит при нагревании геля до 150-200⁰С.

При нагревании до более высокой температуры в интервале 200-400°С активность теряется в результате образования связей Si-O, происходящего с отщеплением воды. Эта стадия, однако, обратима. При нагревании выше 400°С размер поверхности силикагеля необратимо уменьшается.

Активные центры взаимодействуют с полярными растворенными веществами главным образом за счет образования водородных связей. [20]

В зависимости от гранулометрического состава, формы частиц и характера пористости силикагели обозначают четырьмя буквами: первая буква характеризует размер гранул, вторая- (всегда С)- силикагель, третья- размер пор, последняя форму частиц. Так, крупный силикагель мелкопористый гранулированный обозначают КСМГ, мелкий силикагель мелкопористый кусковой - МСМК. Средние фракции силикагеля называют "шихтой" и обозначают: ШСМК, ШСКГ, ШСМГ. Индикаторный силикагель (ГОСТ 8984-58) -силикагель, пропитанный солями кобальта. В зависимости от влажности среды он изменяет цвет от светло-голубого до розового.

Выпускается силикагель в виде шариков или кусочков неправильной формы с зернами размером в пределах 0,1-7,0 мм. В зависимости от аппаратурного оформления рекомендуют следующий гранулометрический состав силикагеля: 0,1-0,25 мм - для процессов с кипящим слоем адсорбентов; 0,5-2,0 мм - для жидкофазных процессов и процессов с движущимся слоем адсорбента; 2,0 - 7,0 мм - для процессов в газовой фазе со стационарным слоем адсорбента.

Косвенной характеристикой структуры является насыпная плотность. Силикагель мелкопористый имеет плотность около 700 г/л, а крупнопористый - от 400 до 500 г/л. Механическая прочность как от истирания так и от раздавливания также различна: у мелкопористого она более высокая.

Промышленный силикагель содержит некоторое количество примесей - оксидов алюминия, железа, кальция и других металлов. Некоторые из них активные катализаторы и они способствуют протеканию крекинга при регенерации; в результате на поверхности силикагеля образуется кокс, снижающий активность поглотителя. Учитывая это, для осушки газов, в которых присутствуют высококипящие углеводороды, используют более чистые силикагели с наибольшим содержанием диоксида кремния.

Динамическая адсорбционная способность силикагеля по влаге зависит: 1 - от размера зерна; 2 - скорости потока; 3 - содержания влаги в газе. [21]

Рисунок 6 - Динамическая адсорбционная способность слоя мелкопористого силикагеля (h=0,3 м) при разном размере зерна и скорости потока (W, м/с). Осушка до точки росы -60°С

- крупнопористый силикагель; 2 - среднепористый; 3 - мелкопористый

Рисунок 7 - Динамическая адсорбционная способность слоя силикагелей (h=1 м) при разной скорости потока: а) осушка для "проскоковой" концентрации, соответствующей точки росы t_р=-40°С; б) то же, t=0°С

Ввиду гидрофильных свойств поверхности силикагеля его часто используют для осушки воздуха, углекислого газа, водорода, кислорода, азота, хлора и других промышленных газов.

Способность силикагеля поглощать значительные количества воды существенна также для осушки различных жидкостей, в особенности в том случае, когда обезвоживаемая жидкость плохо растворяем воду. Силикагели служат также осушителями при консервации оборудования для предохранения его от коррозии.

Наряду с водой силикагель хорошо сорбирует пары многих органических веществ. Этим его свойством пользуются для улавливания паров ценных органических растворителей - бензина, бензола, эфира, ацетона и т.п. из воздуха, бензола из газовых коксовых печей и бензина из природных газов.

С помощью геля кремневой кислоты проводится хроматографическое разделение и анализ смесей, что основано на избирательности адсорбционного действия силикагеля по отношению к веществам различной химической природы. Приведенные примеры, далеко не охватывающие всех областей практического применения силикагеля, характеризуют лишь главные направления, на которых особенно четко проявляются его свойства. Интерес к силикагелю связан с сочетанием в нем ряда ценных качеств: высокой адсорбционной способности, избирательности адсорбционного действия, способности подвергаться многократной регенерации без потери адсорбционной активности, относительно большой прочности зерен, термостойкости, возможности получения его в гранулированном и порошкообразном состоянии и др.

Важнейшим преимуществом силикагеля по сравнению с природными пористыми материалами (пемза, асбест) является возможность изменения его структуры в процессе формирования. Это обстоятельство является особенно важным потому, что степень и характер пористости силикагеля обусловливают эффективность его применения в различных процессах. При данной пористой структуре адсорбционная активность определяется концентрацией адсорбируемого вещества и размером его молекул.

Для хроматографического разделения веществ выбор величины удельной поверхности и размеров пор зависит от свойств разделяемых молекул: для низших углеводородов нужна большая поверхность и более узкие поры, для высших - низкая поверхность и широкие поры. Хорошее разделение неполярных газов, которые адсорбируются в основном благодаря неспецифическим дитерсионным взаимодействиям, достигается в случае тонкопористых силикагелей со средним диаметром пор не более 20 Ȧ. Для разделения легких углеводородов пригодны силикагели диаметром пор от 50 до 200 Ȧ. Силикагели, у которых средний размер пор больше 500 Ȧ, можно использовать для газохроматографического разделения жидких смесей, в частности углеводородов. Макропористые силикагели с низкой удельной поверхностью могут найти широкое применение как носители неподвижных жидких и твердых фаз в газовой хроматографии, в катализе, при адсорбции высокомолекулярных соединений и полимеров из растворов. [22]

Пористая структура силикагеля, как и других гелеобразных адсорбентов, формируется также и в процессе сушки. Объем геля при сушке уменьшается в десять и больше раз. Поскольку пористая структура жестких силикагелей при смене элементов не меняется, то не наблюдаются и изменения селективности разделительной системы, если только геометрия растворенных полимерных молекул не зависит от вида растворителя. Пути регулировки пористой структуры силикагеля позволяют изменить удельные поверхности при одновременном изменении пористости или получать адсорбенты с одинаковой удельной поверхностью, но разными объемом и радиусом пор. Таким образом, Планк и Дрейк пришли к заключению, что пористая структура силикагеля определяется размерами и плотностью упаковки составляющих гель частиц. [23]

1.4 Явление люминесценции

Люминесценция - излучение, представляющее собой избыток над тепловым излучением тела и продолжающееся в течение времени, значительно превышающего период световых колебаний.

В отличие от рассеяния света, при люминесценции между поглощением и испусканием происходят промежуточные процессы, длительность которых больше периода световой волны. Однако критерий сравнения длительности этих процессов с периодом световой волны недостаточен, чтобы, например, отделить резонансное рассеяние от так называемой резонансной флуоресценции. При большом времени жизни возбуждённого состояния акт резонансного рассеяния длится долее периода световых колебаний, как и процессов когерентного испускания света, системой атомов. Однако в этих процессах сохраняются определенные соотношения между фазами поглощённой и испущенной световых волн, в то время как при люминесценции эта корреляция утрачивается. Поэтому целесообразно отделять люминесценцию от других процессов по времени фазовой релаксации поляризации среды.

Существует большое количество разнообразных как органических, так и неорганических веществ, обладающих люминесцентной способностью, свойства которой могут быть существенно неодинаковыми. Эти различия вызывают необходимость в классификации явлений люминесценции.

В основу первой попытки такой классификации была положена продолжительность процесса излучения [24]. В результате такой классификации все известные виды люминесценции были разделены на два больших класса.

По длительности свечения различают флуоресценцию (быстрозатухающую люминесценцию) и фосфоресценцию (длительную люминесценцию). Это деление условное, оно зависит от временного разрешения регистрирующих приборов. Иногда термины "флуоресценция" и "фосфоресценция" используют, чтобы отличить люминесценцию, происходящую при переходах с синглетных уровней, от переходов, происходящих с метастабильных триплетных уровней. [25]

По механизму элементарных процессов различают резонансную, спонтанную, метастабильную, или вынужденную, и рекомбинационную люминесценцию.

В основу второго типа классификации были положены различные виды возбуждения люминесценции: фотолюминесценция [26], атомная флуоресценция [27], катодолюминесценция [28], рентгенолюминесценция [29], радиолюминесценция, электролюминесценция [30], хемилюминесценция.

В основу третьего вида классификации, предложенного С.И.Вавиловым, положена кинетика самого процесса люминесценции [31]. Согласно ему свечение разделяют на резонансное, спонтанное, вынужденное и рекомбинационное.

Люминесцировать могут вещества во всех агрегатных состояниях - газы и пары, растворы органических веществ, стёкла, кристаллические вещества; основное условие - наличие дискретного спектра. Вещества с непрерывным энергетическим спектром (например, металлы в конденсированном состоянии) не люминесцируют, так как в них энергия возбуждения непрерывным образом переходит в теплоту. Кроме того, для возникновения люминесценции вероятность излучательных переходов должна превышать вероятность безызлучательного. Соотношение между этими вероятностями определяет эффективность люминесценции. Интенсивность люминесценции зависит от интенсивности возбуждения, поэтому не может служить характеристикой люминесценции. Более однозначная характеристика - выход люминесценции - отношение энергии люминесценции к поглощённой энергии возбуждения (при фотолюминесценции - квантовый выход люминесценции - отношение числа испущенных и поглощённых квантов света). [32]

В данной работе в качестве люминесцентной метки были использованы органические красители эритрозин, эозин G и родамин 6G. Выбор этих красителей не случаен и обусловлен высокой интенсивностью люминесцентного сигнала, а также традиционностью использования этих красителей в биологических исследованиях.

Рисунок 8 - Зависимость спектра поглощения водного раствора красителя эритрозина от pH растворителя

Зависимость на рисунке 8 получена в работе [33]. Как видно из рисунка, пик поглощения красителя эритрозина наблюдается на длине волны 525 нм.

Рисунок 9 - Спектр замедленной флуоресценции эритрозина как функция температуры

На рисунке 9 представлены спектры замедленной флуоресценции красителя эритрозина в пленках сахарозы при температурах 5, 15, 25, 35, 45, 55, 65, 75, 95 и 100°С. Располагаются графики по порядку сверху вниз в окрестности длины волны 670 нм. Эта зависимость получена в работе [34]. Максимум спектра быстрой флуоресценции красителя эритрозина наблюдается на длине волны 553 нм.

Рисунок 10 - Спектр люминесценции чистого водного раствора родамина 6G при возбуждении лазером диодной накачки с λ=532 нм

Максимум люминесценции родамина 6G приходится на 552 нм.

Рисунок 11 - Спектр поглощения чистого водного раствора родамина 6G

Максимум поглощения родамина 6G приходится на 530 нм.

Рисунок 12 - Спектр люминесценции чистого водного раствора эозина G при возбуждении лазером диодной накачки с λ=532 нм

Максимум люминесценции эозина G наблюдается при 547 нм.

Рисунок 13 - Спектр поглощения чистого водного раствора эозина G

Максимум поглощения эозина G приходится на 525 нм.

2. Описание экспериментальных установок и методик проведения экспериментов

2.1 Люминесцентная установка с возможностью откачки воздуха из кюветы с образцом

В рамках данной дипломной работы был проведен эксперимент по установлению влияния концентраций молекул кислорода на интенсивность люминесценции растворов красителей с гемоглобином в пористых средах.

Исследования проводились люминесцентно-оптическим методом. Фиксируя изменение интенсивности люминесценции растворов, можно судить о ее зависимости от присутствия в молекулах гемоглобина молекулярного кислорода. Схема установки приведена на рисунке 14.

- аппарат лазерный АТС 53-250; 2 - вакуумный насос; 3 - вакуумируемая кювета с образцом; 4 - монохроматор; 5 - ФЭУ; 6 - ЭВМ.

Рисунок 14 - Схема экспериментальной установки