Дипломная (вкр): Влияние молекулярного кислорода на спектрально-оптические свойства окрашенных растворов гемоглобина в пористой среде

Влияние молекулярного кислорода на спектрально-оптические свойства окрашенных растворов гемоглобина в пористой среде

Министерство образования и науки Российской Федерации

Федеральное Государственное бюджетное

образовательное учреждение

высшего профессионального образования

"оренбургский государственный университет"

Физический факультет

Кафедра радиофизики и электроники

выпускная квалификационная работа

Влияние молекулярного кислорода на спектрально-оптические свойства окрашенных растворов гемоглобина в пористой среде

Оренбург 2015

ЗАДАНИЕ

на выполнение выпускной квалификационной работы

студентке Евминовой Светлане Николаевне

по направлению подготовки (специальности) 010707.65 - Медицинская физика

Тема выпускной квалификационной работы (Утверждена приказом № 1948 - С от 15.12.2014)

Влияние молекулярного кислорода на спектрально-оптические свойства окрашенных растворов гемоглобина в пористой среде

Срок сдачи студентом ВКР "01" июня 2015 г.

Цель и задачи выпускной квалификационной работы

Целью данной работы является экспериментальное исследование влияния молекулярного кислорода на спектрально-оптические свойства растворов гемоглобина с применением разных красителей в кислородопроницаемых и пористых средах.

Для выполнения цели работы необходимо решить следующие задачи:

.1 Изучить влияние молекулярного кислорода на спектрально-оптические характеристики белковых молекул

.2 Изучить влияние параметров силикагеля на спектрально-оптические свойства окрашенных раствором.

.3 Провести эксперименты по влиянию молекулярного кислорода на спектрально-оптические свойства окрашенных растворов гемоглобина в пористой среде.

Исходные данные к выпускной квалификационной работе

.1 Статьи и монографии по вопросам строения, функционирования и особенностей молекулы гемоглобина, а также статьи о динамике процессов присоединения молекулярного кислорода к молекулам гемоглобина;

.2 Приборы и оборудование: спектрофотометр Т-70, люминесцентная установка на базе монохроматора МДР-204, лабораторные весы HR-60, лазер blue laser torch, кинетическая спектральная установка.

.3 Программное обеспечение спектрофотометра Т-70, программное обеспечение монохроматора ВДР-204, программный пакет MicroCAL Origin 7.5 Pro.

Перечень графического материала

Иллюстративный материал должен грамотно отражать все результаты дипломной работы, включая выбор пористой среды, влияние молекулярного кислорода на люминесценцию окрашенных растворов гемоглобина в силикагеле.

Дата выдачи и получения задания

Руководитель"17" декабря 2014 г. _________ В.Н.Степанов

Студент"17" декабря 2014 г. _________ С.Н.Евминова

Содержание

Введение

. Процесс взаимодействия гемоглобина с молекулами кислорода

1.1 Важность молекулярного кислорода в дыхательном процессе

.2 Роль гемоглобина как переносчика кислорода

.3 Пористая структура - силикагель

.4 Явление люминесценции

2. Описание экспериментальных установок и методик проведения экспериментов

2.1 Люминесцентная установка с возможностью откачки воздуха из кюветы с образцом

.1.1 Аппарат лазерный АТС 53-250

.1.2 Вакуумный мини-насос Милливак

.1.3 Монохроматор МДР-204

.2 Лазерный кинетический спектрохронограф с возможностью откачки воздуха из кюветы с образцом

.2.1 Импульсный лазер LQ529

.2.2 Осциллограф цифровой GDS-840 С

.3 Спектрофотометр Т70

.4 Электронные лабораторные весы HR-60

.5 Приготовление растворов

.6 Методика заливки пленок

.7 Проведение экспериментов

3. Результаты экспериментов

3.1 Абсорбционный эксперимент

.2 Люминесцентный эксперимент с жидкими растворами красителей и гемоглобина

.3 Статистический анализ люминесценции пористых образцов, окрашенных раствором красителей и гемоглобина

.4 Люминесцентный эксперимент с пористыми образцами, окрашенными раствором красителей и гемоглобина с откачкой воздуха

.5 Кинетический эксперимент с пленками силикагеля, окрашенного растворами красителей с гемоглобином и покрытого ПВБ

Основные результаты и выводы

Заключение

Список использованных источников

Введение

Гемоглобин - белок эритроцитов, красных кровяных клеток, переносящий молекулярный кислород от легких к тканям в организмах позвоночных животных. Гемоглобин можно считать своего рода модельным белком, структура, свойства и функции которого наиболее полно изучены по сравнению с другими белками на протяжении последних 50 лет. Американский физик Хопфилд назвал его атомом водорода современной биохимии, имея в виду, что изучение гемоглобина сыграло в биохимии ту же роль, что и изучение атома водорода в физике. Гемоглобин называют также почетным ферментом, поскольку исследования его структуры в статике и динамике позволили значительно продвинуться в понимании механизмов функционирования ферментов. Структура этого глобулярного белка известна в деталях главным образом благодаря работам английского биофизика Макса Перуца, который получил первые рентгеноструктурные данные еще в конце 40-х годов нашего века. За эти исследования он был удостоен Нобелевской премии.

Большая часть знаний о физиологии человека и многие аспекты патологии берут свое начало от исследований гемоглобина. Его белки изучались путем кристаллографии структур, клонированием и секвенированием генов, изучением ДНК. Стала известна роль гемоглобина в транспорте оксидов азота и комплексный контроль альфа и бета глобиновых генов. Эти данные позволили начать использовать гидроксимочевину для увеличения уровня фетального гемоглобина при серповидно-клеточной анемии.

Изучение структуры белков методом рентгеноструктурного анализа началось в конце 1930-х гг., когда Дж.Бернал, Д.Кроуфут-Ходжкин, Д.Филлипс и другие стали получать первые рентгенограммы белковых кристаллов. В то время метод рентгеноструктурного анализа применялся в основном для изучения структуры простых молекул. Белковые молекулы были настолько сложными, что в течение последующих 15 лет ученым так и не удалось добиться существенных успехов при изучении их структуры. Однако сам метод за это время значительно усовершенствовался с технической стороны.

Стремительный прогресс в области рентгеноструктурного анализа начался в 1953 г. с разработки Перуцем метода изоморфного замещения (введение атомов тяжелых металлов в молекулы кристаллических белков). Этот прием позволил использовать рентгеноструктурный анализ для исследования белка гемоглобина.

Пока Перуц разбирался с молекулой гемоглобина, Кендрю успешно применил его метод тяжелых атомов для изучения структуры сравнительно простого белка миоглобина кашалота.

В ранних работах по изучению структуры гемоглобина Перуц получал проекции молекул на плоскости. Однако, как писал впоследствии Кендрю [1], анализ таких изображений, являвшихся по существу лишь силуэтами очень сложных молекул, давал мало сведений об их структуре. Было очевидно, что при дальнейшем использовании метода необходимо ввести в него такие усовершенствования, которые бы позволяли исследовать структуры в системе трех координат.

В результате работы с миоглобином при использовании метода изоморфного замещения Кендрю в 1957 г. на основе рентгеноструктурного анализа впервые получил трехмерную модель этой молекулы с разрешение до 6 Ȧ. Хотя такое разрешение было недостаточным для выявления боковых цепей и даже конфигурации самой полипептидной цепи, оно давало картину общего расположения полипептидной цепи и группы гема, другими словами, позволяло определить в общем виде третичную структуру молекулы. Как вспоминал позднее Кендрю, "мы увидели нечто, чего никто ранее не увидел… Это была трехмерная структура молекулы белка во всей ее сложности" [2].

Применив для обработки результатов анализа ЭВМ, в 1959 г. Кендрю расшифровал пространственное строение молекулы миоглобина. Он построил также модель, дающую представление о положении большинства из 2500 атомов этой молекулы.

Между тем, продолжая свои исследования, Перуц с сотрудниками получил также трехмерное изображение молекулы гемоглобина лошади с разрешением до 5,5 Ȧ. Расшифровка структуры этой более крупной белковой молекулы была значительно облегчена результатами, полученными при изучении третичной структуры миоглобина кашалота. Оказалось, что структура миоглобина чрезвычайно близка к третичной структуре каждой из четырех субъединиц гемоглобина. Вот как об этом вспоминал сам Перуц: "Летом 1959 года, почти через 22 года после того, как я получил первую рентгенограмму гемоглобина, мы смогли наконец построить трехмерную карту электронной плотности гемоглобина с разрешающей способностью 5,5 ангстрем, подобно той, которая на два года раньше была получена для миоглобина. И как только цифры со счетчика были перенесены на контурную карту, мы убедились в том, что каждая из четырех цепей гемоглобина по форме очень напоминает единственную цель миоглобина. Бета-цепь и миоглобин были вообще идентичны, а альфа-цепь отличалась от них лишь более коротким поперечником одной маленькой петли. Миоглобин был экстрагирован Кендрю из мышц кашалота. Гемоглобин был получен из крови лошадей. Позднейшие исследований показали, что миоглобин тюленя и лошади, гемоглобин человека и коровы имеют также сходное строение" [3].

Молекулы гемоглобина человека состоят из плотно упакованных протеинов, состоящих из симметричных спаренных димерных полипептидных цепей: альфа и бета- глобинов, в тетрамерных структурно-функциональных единицах. Альфа2/бета2 молекулярные формы - основные структурные единицы гемоглобина взрослого человека. Основная функция гемоглобина у млекопитающих - транспорт кислорода от легких к тканям; он вовлечен в специфический транспорт трех других газов: углекислого газа, монооксида углерода (угарного газа) и нитрида азота (NO).

Функциональное значение гемоглобина главным образом определяется особенностью крепления аминокислотных цепей в глобиновых белках, включающих 7 витков в альфа цепи и 8 витков в бета цепи.

Рисунок 1 - Рентгеноструктурный анализ молекулы гемоглобина, показывающий ее высокую компактность в эритроците

На рисунке 1 под буквой А изображено положение β-спирали (показано в виде трубок) в каждой β-единице - одна слева и одна повернута на 180°, справа - показано, как 4 гемовых группы с атомами железа связывают молекулы газа. Также показано место серповидной мутации в мутантной β-глобиновой цепи и цистеин в 93 положении. Молекулы гемоглобина в эритроцитах, как показано на вставке справа, плотно упакованы (концентрация 34 г/дЛ) и мало контактируют с растворителем. Это позволяет кислороду не только эффективно перемещаться в каждой клетке, но и влиять на химический состав молекулы. Например, полимеризации гемоглобина в серповидной клетке при незначительной деоксигенации, на рисунке под буквой В показаны изменения четвертичной структуры гемоглобина в тетрамере при переходе от окси конформации (слева) к дезокси конформации (справа). Атомы железа смещены относительно плоскости групп гемма и центральная полость между β-цепями, открываясь, облегчает связи с 2.3 BPG.

Гемоглобин - один из наиболее хорошо изученных белков. Десятки лет исследований гемоглобина во многих лабораториях мира привели к значительному прогрессу в описании и понимании физических, химических и биологических аспектов его функционирования. Работы Макса Перуца и его сотрудников в Кавендишской лаборатории (Кембридж, Великобритания) внесли огромный вклад в исследование этого белка. Однако важность этих работ касается не только гемоглобина. Они послужили основой развития современных представлений о механизмах ферментативного катализа, связав непосредственно кинетику и термодинамику биохимических реакций с динамикой конформационных изменений макромолекул белка. Если отвлечься от непосредственной практической пользы полученных результатов для медицины, фармакологии, то фундаментальное значение работ по изучению механизма функционирования гемоглобина заключается в стимулировании прогресса в установлении законов протекания важнейших процессов: ферментативного катализа и внутриклеточной трансформации энергии в биологических системах.

Так как одной из основных функций гемоглобина является перенос молекул кислорода, то наибольший интерес представляет исследование взаимодействия гемоглобина с молекулярным кислородом. Исследования в данной области проводятся традиционно оптико-спектроскопическими методами. В ряду крупных научных центров проводятся изыскания в данном направлении, что указывает на актуальность данной дипломной работы. Специфика данной дипломной работы заключается в том, что все происходящие эффекты наблюдаются в специальных пористых средах. Некоторые органы человека и других животных можно рассматривать как пористые среды, в связи с чем произведена аналогия между исследуемыми образцами и некоторыми органами человека. В качестве аналога пористой среды используется среда - силикагель. В рамках дипломной работы сделан литературный обзор на тему исследования, проведены серии оптико-спектроскопических исследований, получены данные экспериментов и сделан ряд выводов.

1. Процесс взаимодействия гемоглобина с молекулами кислорода

1.1 Важность молекулярного кислорода в дыхательном процессе

Дыхание - это окислительно-восстановительный процесс, идущий с образованием АТФ, при котором роль доноров водорода (электронов) играют органические или неорганические соединения, а акцепторами водорода (электронов) всегда служат неорганические соединения. Если конечным акцептором электронов является молекулярный кислород, то такой дыхательный процесс называется аэробным дыханием.

Очевидно преимущество кислородного (аэробного) типа энергетики перед анаэробиозом. Количество энергии, выделяющейся при окислении данного питательного вещества кислородом, в несколько раз превышает энергию, выделяющуюся при его окислении, например, пировиноградной кислотой, используемой в качестве окислителя при таком распространенном типе брожения, как гликолиз. Такие соотношения обусловлены различиями в окислительно-восстановительных потенциалах пары "кислород/вода" (+ 0,82 В) и "пировиноградная кислота/молочная кислота" (- 0,19 В). Если учесть, что потенциалы основных субстратов дыхания и брожения больше или равны - 0,7 В, то максимальные разности потенциалов окислителя и восстановителя для дыхания будут составлять 0,7 В + 0,82 В = 1,52 В и для гликолиза 0,7 В - 0,19 В = 0,51 В. [4]

История открытия кислорода, как и азота, связана с продолжавшимся несколько веков изучением атмосферного воздуха. О том, что воздух по своей природе не однороден, а включает части, одна из которых поддерживает горение и дыхание, а другая - нет, знали еще в 8 веке китайский алхимик Мао Хоа, а позднее в Европе - Леонардо да Винчи. В 1665 английский естествоиспытатель Р. Гук писал, что воздух состоит из газа, содержащегося в селитре, а также из неактивного газа, составляющего большую часть воздуха. О том, что воздух содержит элемент, поддерживающий жизнь, в 18 веке было известно многим химикам. Шведский аптекарь и химик Карл Шееле начал изучать состав воздуха в 1768. В течение трех лет он разлагал нагреванием селитры (KNO3, NaNO3) и другие вещества и получал "огненный воздух", поддерживающий дыхание и горение. Но результаты своих опытов Шееле обнародовал только в 1777 году в книге "Химический трактат о воздухе и огне". В 1774 английский священник и натуралист Дж. Пристли нагреванием "жженой ртути" (оксида ртути HgO) получил газ, поддерживающий горение. Будучи в Париже, Пристли, не знавший, что полученный им газ входит в состав воздуха, сообщил о своем открытии А. Лавуазье и другим ученым. К этому времени был открыт и азот. В 1775 Лавуазье пришел к выводу, что обычный воздух состоит из двух газов - газа, необходимого для дыхания и поддерживающего горение, и газа "противоположного характера" - азота. Лавуазье назвал поддерживающий горение газ oxygene - "образующий кислоты" (от греч. oxys - кислый и gennao - рождаю; отсюда и русское название "кислород"), так как он тогда считал, что все кислоты содержат кислород. Давно уже известно, что кислоты бывают как кислородсодержащими, так и бескислородными, но название, данное элементу Лавуазье, осталось неизменным. На протяжении почти полутора веков 1/16 часть массы атома кислорода служила единицей сравнения масс различных атомов между собой и использовалась при численной характеристике масс атомов различных элементов (так называемая кислородная шкала атомных масс).