Дипломная (вкр): Влияние молекулярного кислорода на спектрально-оптические свойства окрашенных растворов гемоглобина в пористой среде

Молекулярный кислород (газообразный или жидкий) - парамагнитное вещество, в каждой молекуле О₂ имеется по 2 неспаренных электрона. Этот факт можно объяснить тем, что в молекуле на каждой из двух разрыхляющих орбиталей находится по одному неспаренному электрону. Энергия диссоциации молекулы О₂ на атомы довольно высока и составляет 493,57 кДж/моль.

В свободном виде встречается в виде двух модификаций О₂ ("обычный" кислород) и О₃(озон). О₂ - газ без цвета и запаха. При нормальных условиях плотность газа кислорода 1,42897 кг/м3. Температура кипения жидкого кислорода (жидкость имеет голубой цвет) равна -182,9°C. При температурах от -218,7°C до -229,4°C существует твердый кислород с кубической решеткой (-модификация), при температурах от -229,4°C до -249,3°C - -модификация с гексагональной решеткой и при температурах ниже -249,3°C - кубическая -модификация. При повышенном давлении и низких температурах получены и другие модификации твердого кислорода.

При 20°С растворимость газа О₂: 3,1 мл на 100 мл воды, 22 мл на 100 мл этанола, 23,1 мл на 100 мл ацетона. Существуют органические фторсодержащие жидкости (например, перфторбутилтетрагидрофуран), в которых растворимость кислорода значительно более высокая.

Высокая прочность химической связи между атомами в молекуле О₂ приводит к тому, что при комнатной температуре газообразный кислород химически малоактивен. В природе он медленно вступает в превращения при процессах гниения. Кроме того, кислород при комнатной температуре способен реагировать с гемоглобином крови (точнее с железом II гемма), что обеспечивает перенос кислорода от органов дыхания к другим органам.

Реакции биологического окисления, более эффективные, чем древние энергетические процессы брожения и гликолиза, снабжают живые организмы большей частью необходимой им энергии. Исключение составляют облигатные анаэробы, например, некоторые паразиты, для которых кислород является ядом. Использование кислорода, обладающего высоким окислительно-восстановительным потенциалом, в качестве конечного акцептора электронов в цепи дыхательных ферментов, привело к возникновению биохимического механизма дыхания современного типа. Этот механизм и обеспечивает энергией аэробные организмы [5].

Наличие на Земле кислорода является одним из факторов возможности существования жизни на нашей планете.

Кислород в составе воздуха через дыхательные пути попадает в легкие. Концы самых мелких бронхов в легких заканчиваются множеством тонкостенных легочных пузырьков альвеол - это 500 миллионов пузырьков диаметром 0,2 мм. Здесь и происходит газообмен. Кислород из легочных пузырьков проникает в кровь, а углекислый газ из крови - в легочные пузырьки.

Таким образом, венозная кровь обогащается кислородом и превращается в артериальную. Кислород связывается с гемоглобином, который содержится в эритроцитах, насыщенная кислородом кровь поступает в сердце и выталкивается в большой круг кровообращения. По нему кровь разносит кислород по всем тканям организма.

Поступление кислорода в ткани обеспечивает их оптимальное функционирование, при недостаточном же поступлении наблюдается процесс кислородного голодания - гипоксии [6].

Переносимый кислород находится в крови в двух состояниях. Небольшая часть кислорода находится в растворенном состоянии в плазме. Коэффициент растворимости кислорода в крови невелик и составляет (при температуре 37°С и парциальном давлении кислорода 100 мм ртутного столба) 0,3 об.%. Это значит, что каждые 100 мл нормальной крови могут переносить в растворенном состоянии лишь 0,3 мл кислорода, что явно недостаточно для поддержания жизнедеятельности организма человека.

В процессе эволюции был выработан принципиально другой механизм переноса кислорода кровью. Этот механизм связан с наличием в крови специального сложного белка (хромопротеида), способного обратимо присоединять молекулярный кислород. В организме человека и высших животных таким хромопротеидом является гемоглобин, содержащийся в эритроцитах.

Гемоглобин присоединяет кислород в среде с высоким парциальным давлением кислорода и отдает кислород в среду с низким парциальным давлением. Каждый грамм гемоглобина в нормальных условиях может присоединять 1,34 мл кислорода. Поскольку нормальное содержание гемоглобина в крови составляет 145-170 г/л, то 100 мл крови могут переносить в связанном с гемоглобином состоянии 19-21 мл кислорода [7].

В данной работе проводилось, в частности, воздействие лазерным излучением на пористую среду (с гемоглобином) с высаженными на нем молекулами красителя (люминесцентной метки).

В работе [8] исследована кинетика замедленной флуоресценции, вызванной аннигиляцией триплетных возбужденных центров с мигрирующими ¹Δ_g-возбуждениями молекулярного кислорода.

Нелинейное тушение возбужденных электронных триплетных (Т) состояний молекул красителей, внедренных в кислородосодержащие матрицы, возникает в результате реакции аннигиляции Т- и ¹Δ_g(О₂)-возбуждений [9]. Временнáя зависимость концентрации Т-центров n_T(t|n₀) для различных начальных плотностей n₀ этих частиц различна, и это легко обнаруживается при изменении накачки системы. Экспериментально измеряемые величины, являющиеся функциями или функционалами от n_T, сохраняют чувствительность к вариациям n₀. В работах [10] и [11] подчеркивалась нетипичная форма временнóй зависимости интенсивности замедленной флуоресценции (ЗФ) I_DF(t) ряда красителей, сопровождающей Т - ¹Δ_g-слияние (кумуляцию энергии). Кроме того, было установлено, что горбообразный характер кинетической кривой свечения связан с сенсибилизированным заселением ¹Δ_g - состояний в реакции

.(1.1)

В начальный момент времени концентрация ¹Δ_g -возбуждений n_Δ равна нулю, а сигнал ЗФ нарастает в течение некоторого времени t_m. В [12] показано, что временные законы n_T(t) и n_Δ(t) формируются как суперпозиции локальных кинетик, получивших специфическое развитие в пространственных областях с различной плотностью n₀. В то же время в [13], установлена возможность мгновенного (10 нс << τ_t, τ_Δ, где τ_t, τ_Δ - времена жизни Т-состояния красителя и ¹Δ_g-состояния молекул О₂ соответственно) однородного измерения концентрации n_T с помощью дополнительного лазерного импульса в произвольный момент времени t₀ в результате лазероиндуцированной необратимой цепочки переходов Т₁ → Т_m ↝S_n.

1.2 Роль гемоглобина как переносчика кислорода

Гемоглобин - железосодержащий дыхательный пигмент крови позвоночных и многих беспозвоночных животных, осуществляющий перенос кислорода от органов дыхания к тканям организма. В крови позвоночных и некоторых беспозвоночных гемоглобин содержится внутри эритроцитов в растворенном состоянии.

Молекула гемоглобина позвоночных животных состоит из белка - глобина и железосодержащей группы - гема. В состав гема входят четыре протопорфириновых кольца, каждое из которых содержит атом двухвалентного железа. Молекулярный вес гемоглобина - 66 000- 68 000. Физиологическая функция гемоглобина как переносчика кислорода основана на его способности обратимо связывать кислород в зависимости от концентрации последнего в крови. В присутствии кислорода железо гема связывает одну молекулу кислорода, при этом гемоглобин превращается в оксигемоглобин. При взаимодействии гемоглобина с окисью углерода (например, при отравлении этим газом) образуется более стабильный комплекс - карбоксигемоглобин.

Продуктами распада гемоглобина являются многочисленные железопорфириновые комплексы. При этом происходит полное отделение гема от белка (хромопротеида); это отделение протекает с превращением железа в трехвалентную форму. Получаемый железопротопорфирин называется гемином, а его соединения - геминодериватами.

Рисунок 2 - Структура гема гемоглобина

Молекула гемоглобина состоит из четырех субъединиц: двух α и двух β - и соответственно содержит четыре полипептидные цепочки двух сортов. Каждая α-цепочка содержит 141, а β-цепочка - 146 аминокислотных остатков. Таким образом, вся молекула гемоглобина включает 574 аминокислоты. Хотя аминокислотные последовательности α- и β-цепочек различны, они имеют практически одинаковые третичные пространственные структуры. Собственно говоря, приведенные выше детали структуры относятся не к гемоглобину, а к его белковой компоненте - глобину. Каждая субъединица гемоглобина содержит одну небелковую (так называемую простетическую) группу - гем. Гем представляет собой комплекс Fe(II) с протопорфирином. Структура гемма представлена на рисунке 2.

Группировка гема представляет собой сложную копланарную циклическую систему, состоящую из центрального атома, который образует координационные связи с четырьмя остатками пиррола, соединенными метановыми мостиками (= СН -). В гемоглобине железо обычно находится в состоянии окисления (2+).

Четыре субъединицы - две α и две β - соединяются в единую структуру таким образом, что α -субъединицы контактируют только с β -субъединицами и наоборот, как показано на рисунке 3.

Рисунок 3 - Схематичное изображение четвертичной структуры гемоглобина: Fe - гем гемоглобина

Как видно из рисунка 3, одна молекула гемоглобина способна переносить 4 молекулы кислорода. И связывание, и освобождение кислорода сопровождается конформационными изменениями структуры α - и β -субъединиц гемоглобина и их взаимного расположения в эпимолекуле. Этот факт свидетельствует о том, что четвертичная структура белка не является абсолютно жесткой.

Атом железа может образовать шесть координационных связей. Четыре связи направлены к атомам азота пиррольных колец, оставшиеся две связи - перпендикулярно к плоскости порфиринового кольца по обе его стороны. Гемы расположены вблизи поверхности белковой глобулы в специальных карманах, образованных складками полипептидных цепочек глобина. Гемоглобин при нормальном функционировании может находиться в одной из трех форм: феррогемоглобин (обычно называемый дезоксигемоглобином или просто гемоглобином), оксигемоглобин и ферригемоглобин (называемый также метгемоглобином). В феррогемоглобине железо находится в закисной форме Fe(II), одна из двух связей, перпендикулярных к плоскости порфиринового кольца, направлена к атому азота гистидинового остатка, а вторая связь свободна. Кроме этого гистидинового остатка, называемого проксимальным (соседним), по другую сторону порфиринового кольца и на большем расстоянии от него находится другой гистидиновый остаток - дистальный гистидин, не связанный непосредственно с атомом железа. Взаимодействие молекулярного кислорода со свободным гемом приводит к необратимому окислению атома железа гемма [Fe(II) → Fe(III); гем → гемин]. В дезоксигемоглобине глобин предохраняет железо от окисления.

Обратимое присоединение кислорода (оксигенация), позволяющее гемоглобину выполнять свою основную функцию переносчика, обеспечивается возможностью образовать прочные пятую и шестую координационные связи и перенести электрон на кислород не от железа (то есть окислить Fe²⁺), а от имидазольного кольца проксимального гистидина.

Для связывания кислорода с гемоглобином характерна кооперативность: после присоединения первой молекулы кислорода связывание последующих облегчается. В этом проявляется так называемый аллостерический эффект [15].

Стоит заметить, что лазерное излучение оказывает влияние на процесс оксигенации гемоглобина. Авторы работы [16] измеряли величину насыщения артериальной крови кислородом первой фаланги пальца с помощью высокочувствительного быстродействующего пульсоксиметра. Третью фалангу пальца подвергали облучению He-Ne лазера (20 мВт).

На рисунке 4 представлено изменение величины насыщения артериальной крови кислородом при воздействии лазерного излучением.

Рисунок 4 - Влияние лазерного излучения на насыщение артериальной крови кислородом

На кривой насыщения регистрируются изменения от дыхательных циклов: 40 секунд - начало воздействия, 170 секунд - окончание. Снижение насыщения гемоглобина синхронное с воздействием, демонстрирует дополнительное освобождение кислорода в результате фотодиссоциации гемоглобина. Это не может быть связано с улучшением микроциркуляции. Все происходит слишком быстро и синхронно. Таким образом, это значит, что низкоинтенсивное лазерное облучение высвобождает кислород в месте облучения. Авторы говорят о лазерно-индуцированной оксигенации тканей. Речь идет о селективном повышении локальной концентрации кислорода в тканях. Авторы объясняют этот эффект сдвигом кривой диссоциации оксигемоглобина. И обосновывают это совпадением спектра поглощения гемоглобина и оксигемоглобина с длиной волны He-Ne лазера. То есть, по мнению авторов, оксигемоглобин является акцептором фотона.

Большой интерес для исследователей представляют особенности поведения молекул газов (лигандов) в гемовом кармане гемоглобина и миоглобина. В работе [16] рассмотрены механизмы диффузии лигандов в миоглобине, строение которого очень сходно со строением β-субъединицы молекулы гемоглобина.

Результат расчетов Д. Кейза и М. Карплюса в 1979 году оказался по тем временам несколько неожиданным. Выяснилось, что скорость диффузии лиганда в белке чрезвычайно чувствительна к виду межатомных потенциалов взаимодействия, определяющих конформационную подвижность. Конформационная подвижность обусловлена возможностью вращения молекулярных групп вокруг одинарных С-С-связей [17]. В вакууме при повороте на полный угол преодолеваются обычно три потенциальных барьера высотой ~ 2-4 ккал/моль. В плотноупакованной белковой глобуле эти вращения сильно заторможены из-за стерических препятствий, и, казалось бы, ими можно пренебречь и рассматривать только небольшие колебания атомов около локальных положений равновесия. Расчет динамики связывания лиганда с миоглобином показал, что в этом случае энергия активации диффузии составляет ~ 100т ккал/моль, что примерно в 10 раз больше экспериментальной величины, и процесс при комнатных температурах практически заморожен. Этот результат полностью опроверг представление о белковой глобуле как об апериодическом микрокристаллике. Оказалось, что включение в расчет конформационных степеней свободы совершенно принципиально для белков и снижает энергию активации диффузии лиганда до приемлемого значения ~ 10 ккал/моль. Более того, оказалось, что в структуре миоглобина можно выделить два канала для проникновения лиганда из раствора в гемовый карман. Эти каналы работают с вероятностью около 60 и 40% соответственно и по своей структуре представляют систему флуктуационно открывающихся щелей (дверей), образованных аминокислотными остатками. На рисунке 5 схематически показан путь миграции СО в молекуле гемоглобина из гемового кармана параллельно гемовой плоскости через участок альфа-спирали Е по наиболее эффективному каналу. Молекула СО сначала преодолевает участок между гистидином HisE7 и валином ValEll, а затем между HisE7 и треонином ThrElo с дальнейшим выходом в растворитель.

Рисунок 5 - Схематическое изображение одного из каналов для диффузии лиганда в миоглобине

На рисунке 5 шариком указано место расположения связанного СО в гемовом кармане. Пунктир показывает путь выхода лиганда в растворитель. Плоскость рисунка параллельна гемовой плоскости и находится над ней на расстоянии 3,2 Ȧ. Обозначены положения аминокислотных остатков с указанием спирального участка и номера остатка в спирали (HisE7, ValE11, ThrE10); положение первого аминокислотного остатка в неспирализованном участке, соединяющем спирали С и D (CD1Phe); участок одной из пропионатных боковых цепей, присоединенных к молекуле гемма (3 prop).