Статья: Устойчивость к тяжелым металлам ацидофильных хемолитотрофных бактерий, выделенных из техногенного сырья

Одесский национальный университет имени И. И. Мечникова

Устойчивость к тяжелым металлам ацидофильных хемолитотрофных бактерий, выделенных из техногенного сырья

И.А. Блайда, Т.В. Васильева,

Л.И. Слюсаренко, Н.Ю. Васильева

Цель. Определение устойчивости к ионам тяжелых металлов ацидофильных хемолитотрофных бактерий, изолированных из отвальных пород топливно-энергетического комплекса Украины. Методы. Бактерии культивировали на агаризованной среде Сильвермана-Лундгрема 9К в присутствии ионов меди, цинка, никеля, кобальта и кадмия в диапазоне концентраций 0,5-12,0 г/дм³ с интервалом 0,5 г/дм³, в присутствии ионов свинца в диапазоне 0,25-1,50 г/дм³ с интервалом 0,05 г/дм³. Мезофильные бактерии культивировали при 35,0±0,2 °С, умеренно термофильные - при 50,0±0,2 °С в течение семи суток. Учет результатов осуществляли визуально. Результаты. Полученные результаты свидетельствуют о высоком уровне резистентности изолированных штаммов бактерий родов Acidithiobacillus и Sulfobacillus к различным ионам тяжелых металлов. Минимальные ингибирующие концентрации (МИК) металлов для изученных штаммов в несколько раз превышали их содержание в отвальных породах топливно-энергетического комплекса. Установлен ряд токсичности ионов металлов по отношению к выделенным бактериям: наиболее токсичным оказался Pb²+ (МИК для всех штаммов находилась в диапазоне 0,35-0,70 г/дм³), наименее токсичным - Cu²+ (МИК достигала 11,5 г/дм³). Определен ряд устойчивости изолированных штаммов ацидофильных хемолитотрофных бактерий родов Acidithiobacillus и Sulfobacillus по отношению к ионам токсичных металлов. Максимальной устойчивостью обладали штаммы, изолированные из отходов обогащения углей, минимальной - штаммы, изолированные из отходов сжигания углей. Выводы. Выделенные из техногенного сырья ацидофильные хемолитотрофные бактерии относятся к полирезистентным, так как они проявили высокий уровень устойчивости к широкому кругу ионов тяжелых металлов в широком диапазоне концентраций. Резистентность штаммов зависит от их индивидуальных особенностей и источников выделения. Выявлены межвидовые и внутривидовые различия штаммов по их резистентности, что может быть связано с различными факторами физиологического и генетического характера.

Ключевые слова: ацидофильные хемолитотрофные бактерии, резистентность, ионы тяжелых металлов.

СТІЙКІСТЬ ДО ВАЖКИХ МЕТАЛІВ АЦИДОФІЛЬНИХ ХЕМОЛІТОТРОФНИХ БАКТЕРІЙ, ЩО ВИДИЛЕНІ З ТЕХНОГЕННОЇ СИРОВИНИ

Реферат

Мета. Визначення стійкості до йонів важких металів ацидофільних хе- молітотрофних бактерій, що ізольовані з відвальних порід паливно-енергетичного комплексу України. Методи. Бактерії культивували на агаризовано- му середовищі Сильвермана-Лундгрема 9К у присутності йонів міді, цинку, нікелю, кобальту і кадмію в діапазоні концентрацій 0,5-12,0 г/дм³ з інтервалом 0,5 г/дм³, йонів свинцю - в діапазоні 0,25-1,50 г/дм³ з інтервалом 0,05 г/дм³, мезофільні бактерії культивували при 35,0 ± 0,2 °С, помірно термофільні - при 50,0 ± 0,2 °С протягом семи діб. Облік результатів здійснювали візуально, порівнюючи дослідні варіанти з контрольними; за контроль слугувало середовище 9К без йонів металів. Результати. Отримані результати свідчать про високий рівень резистентності ізольованих бактерій родів АсМШюЬасіїїш і SulfobacШus до різних йонів важких металів. Мінімальні пригнічувальні концентрації металів для вивчених штамів в кілька разів перевищували їх вміст у відвальних породах паливно-енергетичного комплексу. Встановлено ряд токсичності йонів металів по відношенню до виділених штамів: найбільш токсичним виявився йон РЬ²+ (МІК для всіх штамів знаходилася в діапазоні 0,35-0,70 г/дм³), найменш токсичним - йон Си²+ (МІК досягала 11,5 г/дм³). Визначено ряд стійкості ізольованих штамів ацидофільних хемолітотроф- них бактерій родів АсМШюЬасіїїш і Sulfobaaппus по відношенню до йонів токсичних металів. Максимальною стійкістю володіли штами, ізольовані з відходів збагачення вугілля, мінімальною - штами, ізольовані з відходів спалювання вугілля, а також колекційний штам. Висновки. Виділені з техногенної сировини штами ацидофільних хемолітотрофних бактерій відносяться до полірезистентних, так як вони проявили високий рівень стійкості до широкого кола йонів важких металів в широкому діапазоні концентрацій. Резистентність штамів залежить від їх індивідуальних особливостей і джерел виділення. Виявлено міжвидові і внутрішньовидові відмінності штамів за резистентністю, що може бути пов'язано з різними чинниками фізіологічного і генетичного характеру.

Ключові слова: ацидофільні хемолітотрофні бактерії, відвальні продукти паливно-енергетичного комплексу, резистентність, йони важких металів.

RESISTANCE OF ACIDOPHILIC CHEMOLYTOTROPHIC BACTERIA ISOLATED FROM TECHNOGENIC RAW MATERIALS TO HEAVY METALS

Summary

Aim. Determination of resistance to heavy metal ions of acidophilic chemolitho- trophic bacteria isolated from dump products offuel-energy complex of Ukraine. Methods. Traditional microbiological: cultivation of strains were carried out with using of Silverman-Lundgrem 9K medium in the presence of copper, zinc, nickel, cobalt and cadmium ions in the concentration range 0.5-12.0 g/dm³ at intervals 0,5 g/dm³, in the presence of lead in the concentration range 0.25-1.50 g/dm³ at intervals 0,05 g/dm³; crops carried out with a stroke; cultivation of mesophilic strains was carried out at the temperature of 35.0±0.2 °C, moderately thermophilic - at 50.0±0.2 °C within seven days; the results were recorded visually by comparing the experimental options with the control ones; the control was 9K medium without metal ions. Results. The results indicate a high level of resistance of isolated strains of the genera Acidithiobacillus and Sulfobacillus to various heavy metal ions. The metals minimum inhibitory concentrations (MIC) for the studied strains were several times higher than their content in dump products of fuel-energy complex. A series of metal ions toxicity in relation to the isolated strains has been established: Pb²+ ion was the most toxic (MIC for all the strains it was in the range of0.35-0.70 g/dm³), the least toxic was Cu²+ ion (MIC reached 11.5 g/dm³). A number of resistances of isolated acidophilic chemolithotrophic bacteria of the genera Acidithiobacillus and Sulfobacillus with respect to toxic metal ions has been determined. The strains isolated from coal waste dumps possessed the maximum resistance, the minimal strains were those isolated from coal burning wastes, as well as the typical ones. Conclusion. The strains of acidophilic chemolithotrophic bacteria isolated from technogenic raw materials belong to multiresistant ones, since they showed a high level of resistance to a wide range of heavy metal ions in a wide range of concentrations. The resistance of strains depends on their individual characteristics and sources of isolation. Identified interspecific and intraspecific differences of the strains by their resistance, is associated with various physiological and genetic factors.

Key words: acidophilic chemolithotrophic bacteria, dumps of fuel-energy complex, resistance, heavy metal ions.

Введение

Тяжелые металлы являются важной составляющей частью породы земной коры, постоянно присутствуют в биосфере, трансформируются, не подвергаются деградации, мигрируют по трофическим цепям и имеют тенденцию к накоплению в живых организмах. Металлы поступают в окружающую среду естественным путем как результат геохимических и природных процессов, так и антропогенным в результате деятельности предприятий добывающей и перерабатывающей промышленности, транспорта и др. [1, 2, 5]. Контроль за содержанием токсичних элементов в окружающей среде регламентируется понятием «предельно-допустимая концентрация» (ПДК), однако повсеместно, особенно в зонах активной промышленной деятельности, их содержание превышает значения ПДК в десятки и сотни раз. В высоких концентрациях металлы вызывают изменения в природных микробиоценозах, приводя к обеднению их состава и возникновению устойчивых форм. Влияние металлов на микроорганизмы зависит от многих факторов - вида микроорганизма, формы нахождения и концентрации металлов, физико-химических факторов окружающей среды [2, 12, 14]. Устойчивость к тяжелым металлам является важным физиологическим свойством, особенно когда речь идет об использовании микроорганизмов для переработки техногенного полиметаллического сырья.

В настоящее время имеется достаточно обширный материал, касающийся устойчивости к металлам различных групп микроорганизмов, в первую очередь Pseudomonas aeruginosa, Bacillus subtilis, Escherichia coli, Alcaligenes eutrophus, Rhodotorula glutibis. Отечественными исследователями обнаружены устойчивые к металлам штаммы гетеротрофных микроорганизмов как в природных, так и в техногенных экологических нишах. В частности, получены результаты по выделению резистентных штаммов и микробных сообществ из стабильных природных экологических ниш - глин карстовых полостей украинского Подолья и Кавказа, а также природных ниш с экстремальными физико-химическими условиями - почв и фитоценозов Антарктики [3, 4].

Данные о резистентности ацидофильных хемолитотрофных бактерий (АХБ) немногочисленны и касаются в основном штаммов, изолированных из природных источников [11, 13, 17]. В то же время АХБ, входящие в состав сформированного микробного ценоза в техногенном сырье с повышенными концентрациями тяжелых металлов, ожидаемо должны быть высокорезистентными. Однако данные об этом в литературе ограничены.

Целью работы было определение устойчивости к ионам тяжелых металлов ацидофильных хемолитотрофных бактерий, изолированных из микробиоценоза отвальных продуктов топливно-энергетического комплекса (ТЭК) Украины.

Материалы и методы исследований

Исследования проводили с ацидофильными хемолитотрофными мезо- фильными и умеренно термофильными штаммами (табл. 1), выделенными из микробиоценоза отвальных продуктов ТЭК Украины: породных отвалов углеобогащения центральной обогатительной фабрики (ЦОФ) «Червоноград- ская» Львовско-Волынского угольного бассейна (ЛВУБ) различного срока накопления (24-28 месяцев - черного цвета и хранящиеся более 60 месяцев - красного), золошлаков и золы уноса после сжигания угля соответственно на Добротворской и Ладыженской теплоэлектростанциях (ТЭС). Свойства штаммов описаны в предыдущей работе [10].

Таблица 1

Штаммы ацидофильных хемолитотрофных бактерий, выделенных из отвальных продуктов ТЭК

Соответствующие исследования проводились также с коллекционным штаммом Acidithiobacillus ferrooxidans АТСС 23270 из Американской коллекции типовых культур, выделенным из бурого угля шахт США. Все штаммы хранятся в музее кафедры микробиологии, вирусологии и биотехнологии Одесского национального университета имени И. И. Мечникова.

Выделенные штаммы можно отнести к экстремофилам, т.к. они получены из техногенных субстратов, микробиоценоз которых формируется в нестабильных физико-химических и климатических условиях, с высокими концентрациями тяжелых металлов (табл. 2).

Таблица 2

Концентрации тяжелых металлов в отвальных продуктах ТЭК

цидофильный хемолитотрофный бактерия техногенный

Все выделенные от отходов ТЭК штаммы изучали на устойчивость к ионам меди, цинка, никеля, кобальта и кадмия в диапазоне концентраций 0,5-12,0 г/дм³ с интервалом 0,5 г/дм³; к ионам свинца в диапазоне 0,25-1,50 г/дм³ с интервалом 0,05 г/дм³. Выбор этих металлов обусловлен их высокой токсичностью и сочетанием всех известных механизмов подавления жизнедеятельности микроорганизмов [2, 6].

Резистентность штаммов определяли при их культивировании на стандартной среде Сильвермана-Лундгрема 9К состава, г/дм³: K₂HPO₄ - 0,50; (NH₄)₂SO₄ - 3,00; MgSO₄x7H₂O - 0,50; KCl - 0,10; Ca(NO₃)₂ - 0,01. В качестве источников энергии использовали для A. ferrooxidans и Sulfobacillus sp. соль FeSO₄*7H₂O в концентрации 44,5 г/дм³; при культивировании A. thiooxidans - Na₂S₂O₃ в концентрации 5,0 г/дм³. Соли металлов в форме сульфатов растворяли в дистиллированной воде, стерилизовали на кипящей водяной бане в течение 10 мин и вносили в расплавленную агаризованную среду. Контролем служила среда 9К без металлов. Мезофильные штаммы культивировали при 35,0±0,2 °С, умеренно термофильные - при 50,0±0,2 °С в течение семи суток. Учет результатов осуществляли визуально, сравнивая рост штаммов в опытных и контрольных вариантах. Все опыты проводили в трёх повторностях. Минимально ингибирующей считали концентрацию (МИК, г/дм³), при которой еще сохраняется жизнеспособность исследуемого штамма, но полностью отсутствует его рост. Количественный анализ твердых субстратов осуществляли на атомно-эмиссионном спектрометре ЭМАС-200 CCD (Беларусь). Концентрацию металлов в растворах определяли методом атомно-абсорбционной спектроскопии на приборах ААС-1 (Германия) и С-115ПК Selmi (Украина). Микрофотосъемку проводили с помощью светового микроскопа Primo Star PC (Германия). Достоверность полученных результатов оценивали по критерию Стьюдента с вероятностью Р<0,05.

Результаты и их обсуждение

Результаты исследований обобщены в табл. 3 и свидетельствуют о высокой устойчивости выделенных штаммов к широкому спектру ионов тяжелых металлов. Наиболее показательные визуальные проявления резистентности бактерий представлены на рис. 1-4.

Как показали результаты исследований, наиболее токсичным для всех выделенных и изученных штаммов является ион свинца, его МИК составляет 0,35-0,70 г/дм³. На рис. 2 виден слабый рост по штриху выделенных бактерий А. ferrooxidans в присутствии 0,70 г/дм³ Pb²+ по сравнению с контролем (рис. 1). Минимальной токсичностью обладает ион меди: его МИК находится в диапазоне 2,5-11,5 г/дм³, в зависимости от штамма. В общем виде все исследованные ионы тяжелых металлов в порядке убывания их токсичного воздействия на выделенные бактерии родов Acidithiobacillus и Sulfobacillus можно расположить в ряд: