Материал: Тец руководство

Культуры клеток. Представляют собой соматические или эмбриональные клетки животных или человека, культиви­руемые в лабораторных условиях. Клеточные культуры разли­чаются по источнику получения, способности к размножению in vitro и кариотипу. Их подразделяют на первичные (непере­виваемые), полуперевиваемые и перевиваемые.

Первичные культуры клеток получают непосредственно из тканей многоклеточных организмов. Такие клетки обычно не способны к делению (неперевиваемые) и используются одно­кратно.

К полуперевиваемым культурам относятся диплоидные клет­ки различных тканей и органов, способные к ограниченному размножению in vitro. Они представляют собой клеточную систему, сохраняющую в процессе 20—50 пассажей (пересе­вов) — до года — диплоидный набор хромосом, типичный для соматических клеток используемой ткани. Диплоидные клетки при культивировании не претерпевают злокачественного пере­рождения и этим выгодно отличаются от опухолевых.

Перевиваемые культуры клеток готовят из злокачественных линий клеток, обладающих способностью неограниченно раз­множаться in vitro в определенных условиях. К ним относятся, например, злокачественные клетки HeLa, первоначально вы­деленные из карциномы шейки матки, Нер-3 (из лимфоидной карциномы) и др.

Для выращивания клеточных культур используют питатель­ные среды сложного состава, включающие источники энергии, минеральные вещества, аминокислоты, витамины и другие

факторы роста. Клетки чрезвычайно чувствительны к измене­нию рН среды. Для контроля рН в среды добавляют индикатор. Большинство клеточных культур растет в виде монослоя (плас­та, состоящего из одного слоя клеток), прочно прикрепляясь к поверхности контейнера для культивирования — пробирки, пластикового планшета или матраса (флакон 4-гранной фор­мы). Некоторые типы клеток способны расти также в суспен­зии.

Приготовление первичной культуры клеток включает не­сколько последовательных этапов: измельчение ткани, разъ­единение клеток путем трипсинизации, отмывание полученной однородной суспензии изолированных клеток от трипсина с последующим суспендированием клеток в питательной среде, обеспечивающей их рост (например, в среде 199 с добавлением телячьей сыворотки крови). При оседании клетки довольно прочно прикрепляются к стенке пробирки или флакона, по которой распространяются в виде монослоя. После получения монослоя жизнеспособной культуры клеток ее заражают мате­риалом, содержащим риккетсии, хламидии или вирусы. Упо­мянутые микробы проникают внутрь клеток, где и размножа­ются. В культурах клеток удается культивировать большинство вирусов, вызывающих заболевания человека.

Внутриклеточные паразиты оказывают цитопатическое дей­ствие (ЦПД) на клетки, в которых происходит их репродукция. ЦПД может проявляться деструкцией (лизисом) зараженных клеток, изменением их морфологии (изменением размеров и формы самой клетки, клеточного ядра, появлением вакуолей или включений, представляющих собой внутриклеточные скопления вирусов, образованием синцития) и нарушением их функций.

Куриные эмбрионы. Куриные эмбрионы по сравнению с культурами клеток значительно реже бывают контаминиро-ваны вирусами и микоплазмами, а также обладают сравнитель­но высокой жизнеспособностью и устойчивостью к различным воздействиям. Они пригодны для культивирования хламидии, риккетсии и некоторых вирусов, патогенных для человека.

Для получения чистых культур риккетсии, хламидии и ряда вирусов в диагностических целях, а также для приготовления разнообразных препаратов (вакцины, диагностикумы) исполь­зуют 8—12-дневные куриные эмбрионы. К недостаткам данно­го метода относятся невозможность обнаружения исследуемого микроорганизма без предварительного вскрытия эмбриона, а также наличие большого количества белков и других соедине­ний, затрудняющих последующую очистку возбудителя при изготовлении различных препаратов.

Для заражения куриных эмбрионов исследуемый материал вводят в аллантоисную и амниотическую полости, на хорион-аллантоисную оболочку или в желточный мешок куриного

культивирования облигатных внутриклеточных паразитов в ор­ганизме лабораторных животных перед другими состоит в воз­можности выделения тех вирусов, которые плохо репродуци­руются в культуре клеток или эмбрионе. К его недостаткам относятся высокая вероятность контаминации организма по­допытных животных посторонними вирусами и мико плазмами, а также необходимость последующего заражения культуры кле­ток для получения чистой культуры данного вируса, что уве­личивает сроки исследования.

Методы индикации вирусов. Для демонстрации при­сутствия вируса в клеточной культуре используют несколько методов.

I. О размножении (репродукции) вирусов в культуре клеток судят по цитопатическому действию (ЦПД), которое может быть обнаружено микроскопически по морфологическим из­менениям клеток. Часть таких клеток погибает и отслаивается от стенок пробирки. Вирусные частицы, освобождающиеся при разрушении одних клеток, инфицируют другие, которые через некоторое время также погибают. В результате вместо сплош­ного клеточного монослоя остаются лишь отдельные клеточ­ные островки. Характер ЦПД, вызванного разными вирусами, неодинаков. При репродукции одних вирусов (парамиксовиру-сы, герпесвирусы) наблюдается слияние клеток с образованием синцития, других (энтеровирусы, реовирусы) — сморщивание и деструкция клеток, третьих (аденовирусы) — агрегация кле­ток (рис. 5.2.2) и т.д. ЦПД вирусов оценивают в динамике, просматривая культуру клеток под микроскопом в разные сроки после ее заражения вируссодержащим материалом. Не­которые вирусы (энтеровирусы, герпесвирусы) вызывают ЦПД в течение 1—2 сут, другие — в более поздние сроки (на 4—6-й день). Характер ЦПД используют как для обнаружения вирусов (индикации), так и ориентировочной идентификации, т.е. оп­ределения их видовой принадлежности.

Некоторые вирусы можно обнаружить и идентифицировать по включениям, которые они образуют в ядре или цитоплазме зараженных клеток. Форма включений различна, а размеры колеблются от 0,25 до 25 мкм. Они представляют собой места скопления вирусных частиц и могут быть выявлены в препара­тах, приготовленных из зараженной ткани и окрашенных по методу Романовского—Гимзы или флюорохромами. В послед­нем случае используют люминесцентную микроскопию.

В клетках, пораженных риккетсиями, на 3—8-й день отме­чается большое количество коккобациллярных форм, целиком заполняющих цитоплазму или ядро клеток, которые затем гиб­нут. Хламидии также рассматривают в окрашенных по методу Романовского—Гимзы препаратах клеток, в которых образуют­ся цитоплазматические включения, представляющие собой внутриклеточные микроколонии этих бактерий.

способность к метаболизму и погибают, поэтому окраска среды с течением времени не меняется.

П. Реакцию гемадсорбции применяют для индикации гемаг-глютинирующих вирусов. Реакция основана на способности поверхности клеток, в которых репродуцируются такие вирусы, адсорбировать эритроциты. Для постановки реакции гемад­сорбции в культуру клеток, зараженных вирусами, добавляют взвесь эритроцитов и после некоторого времени контакта клет­ки промывают изотоническим раствором хлорида натрия. На поверхности пораженных вирусами клеток остаются прилип­шие эритроциты.

III. Реакцию гемагглютинации (РГА) применяют для обна­ружения гемагглютинирующих вирусов в культуральной жид­кости зараженной культуры клеток либо хорионаллантоисной или амниотической жидкости куриного эмбриона. Гемагглюти-нацию — "склеивание" эритроцитов разных видов животных (кур, гусей, морских свинок) — вызывают вирусы, содержащие в оболочке гемагглютинин. Для постановки реакции гемагглюти­нации к исследуемому материалу добавляют взвесь эритроцитов. В присутствии вирусов происходит агглютинация эритроцитов.

После вскрытия куриного эмбриона аллантоисную жид­кость отсасывают и разливают по 0,5 мл в пробирки или лунки плексигласовой пластины (для контроля берут 0,5 мл такой же жидкости незараженного эмбриона). Затем добавляют по 0,2 мл 1 % суспензии отмытых куриных эритроцитов и выдерживают при комнатной температуре. Результаты реакции учитывают через 40 мин после оседания эритроцитов: (++++) — выражен­ная гемагглютинация — тонкая пленка склеившихся эритроци­тов на дне пробирки, имеющая вид зонтика, (+++) — наличие просветов в пленке, (++) — наличие пленки с фестончатыми краями из склеившихся эритроцитов, (+) — хлопьевидный оса­док эритроцитов, окруженный зоной комочков агглютиниро­ванных эритроцитов, (—) — резко очерченный осадок эритро­цитов, неотличимый от контроля. Наличие гемагглютинации в опытных пробирках при ее отсутствии в контрольных указы­вает на содержание вируса в исследуемой жидкости. Для оп­ределения титра РГА ставят реакцию с разведениями вируссо-держащей жидкости 10~V 10~², 10~³ и т.д. За титр РГА при­нимают максимальное разведение, при котором наблюдается гемагглютинация (++). Титр РГА характеризует активность вируса и используется при постановке РТГА (см. тему 10.2).

Для количественного обнаружения вирусных частиц ис­пользуют методы титрования. Титр вируса можно определить в реакции гемагглютинации с 10-кратными разведениями куль­туральной среды, или материала из куриного эмбриона, или по ЦПД в культуре клеток. В последнем случае клетки культуры заражают 10-кратными разведениями материала, содержащего вирус. После 6—7-дневной инкубации их просматривают на

отношении бактерий. Однако существуют фаги, которые могут поражать только отдельные варианты одного и того же вида бактерий. Их используют для определения фаготипов (фагова-ров) внутри данного вида. Вместе с тем имеются фаги, лизи-рующие родственные виды бактерий. В практической работе фаги применяют для:

фаготипирования бактерий, т.е. определения фаготипа по лизису штаммов бактерий одного и того же вида типоспецифическими фагами, что важно для маркировки исследуемых
бактерий при эпидемиологическом анализе заболеваний;

фагоидентификации бактериальных культур с целью ус­тановления их видовой принадлежности;

фагодиагностики, заключающейся в выделении фага из организма больного (например, из испражнений), что косвен­но свидетельствует о наличии в материале соответствующих
бактерий;

фагопрофилактики — предупреждения некоторых заболе­ваний (например, дизентерии) среди лиц, находящихся в эпи­демическом очаге;

фаготерапии — лечения некоторых инфекционных забо­леваний, вызванных, например, шигеллами, протеем, стафило­кокком.

План

Программа

Методы выделения фагов из объектов окружающейсреды и их идентификация.

Метод титрования фага по Грациа.

Метод обнаружения лизогенных бактерий.

Метод фаготипирования бактерий.

Демонстрация

Методы выделения фага из объектов окружающей среды.

Методика обнаружения лизогенных бактерий.

Задание студентам

Учесть результат титрования бактериофага по методу Грациа.

Определить спектр литического действия бактериофа­га.

Ознакомиться с методом фаготипирования бактери­альных культур. Определить фаговары культур стафи­лококков, выделенных от больных.

Ознакомиться с препаратами бактериофагов, класси­фицировать по назначению.

а Методические указания

Выделение фага из объектов окружающей среды. Для полу­чения вирулентного фага готовят фильтрат, пропуская исход-

65

жание постоянства состава генома, его воспроизведение при размножении и изменчивость, обеспечивающая приспособля­емость, являются обязательными условиями сохранения вида. В основе поддержания постоянства генома лежит работа фер­ментов репликации и некоторых систем репарации ДНК. Изме­нения генетической информации являются результатом мута­ций и рекомбинации. Мутации, различные по происхождению (спонтанные и индуцированные), приводят к изменениям ДНК, имеющейся в клетке. Рекомбинация позволяет также использовать и ДНК других клеток и вирусов, поступающую из окружающей среды.

Тема 6.1. МОДИФИКАЦИОННАЯ ИЗМЕНЧИВОСТЬ, МУТАЦИИ, РЕКОМБИНАЦИЯ И ПЕРЕНОС ГЕНОВ МЕЖДУ БАКТЕРИЯМИ

План

Программа

Способы сохранения генетической информации у микробов.

Модификационная изменчивость.

Мутационная изменчивость.

Рекомбинация ДНК.

Способы передачи генетической информации между бактериями — трансформация, трансдукция, конъ­югация.

Фаговая конверсия.

Сохранение и изменение генетической информации в микробных популяциях.

Демонстрация

S- и R-формы колоний у E.coli.

Таблицы со схемами передачи генетической информа­ции между бактериями в опытах трансформации,
трансдукции и конъюгации.

Задание студентам

Определить частоту образования рекомбинантов Leu⁺ в опыте конъюгации.

Определить частоту образования трансдуктантов (ре­комбинантов) в опыте трансдукции фагом A, dgai

Определить частоту образования трансформантов (ре­комбинантов) в опыте трансформации признака Str^r (стрептомицинрезистентности) у Bacillus subtilis.

Методические указания

Постановка опыта трансформации (рис. 6.1; на вклейке). Реципиент — штамм Bacillus subtilis Str⁵ (сенная палочка, чув­ствительная к стрептомицину); донор — ДНК, выделенная из

штамма B.subtilis Str^r (устойчивого к стрептомицину). Селек­тивная среда для отбора рекомбинантов (трансформантов) — питательный агар, содержащий 100 ЕД/мл стрептомицина. К 1 мл бульонной культуры B.subtilis добавляют 1 мкг/мл ДНК донора. Смесь инкубируют при 37 "С в течение 30 мин. Затем в пробирку вносят смесь 0,1 мкг/мл раствора ДНКазы в 0,5 мл раствора хлорида магния для разрушения ДНК, не проникшей в бактериальные клетки реципиентного штамма, и выдержива­ют в течение 5 мин. Для определения количества образовав­шихся стрептомицинустойчивых рекомбинантов (трансфор­мантов) 0,1 мл неразведенной смеси высевают на селективную среду в чашку Петри. Для определения количества клеток реципиентной культуры в изотоническом растворе хлорида на­трия готовят 10-кратные разведения до 10~⁵— 10~⁶ (для полу­чения сосчитываемого количества колоний), высевают по 0,1 мл на питательный агар без стрептомицина, а для контроля — на агар со стрептомицином. На последней среде реципиентная культура не должна расти, поскольку она чувствительна к стрептомицину. Посев инкубируют при 37 °С. На следующий день учитывают результаты опыта и определяют частоту транс­формации по отношению количества выросших рекомбинант-ных клеток к числу клеток реципиентного штамма.

Допустим, что при высеве 0,1 мл культуры реципиентного штамма в разведении 10~⁵ выросло 170 колоний, а при высеве 0,1 мл нераз­веденной смеси — 68 колоний рекомбинантного штамма. Поскольку каждая колония образовалась в результате размножений только одной бактериальной клеткой, то в 0,1 мл засеянной культуры реципиента содержится 170хЮ⁵ жизнеспособных клеток, а в 1 мл — 170хЮ⁶, или 1,7х10⁸. В то же время в 0,1 мл смеси находится 68 рекомбинант-ных клеток, а в 1 мл — 680, или 6,8x10^. Таким образом, частота трансформации в данном опыте будет равна: