Материал: Тец руководство

водных). Это позволяет различать микробы, принадлежащие к разным видам, по количественному и качественному со­ставу липидов (жирных кислот, эфиров, спиртов, хинонов и т.д.). Анализ химического состава микробных клеток осу­ществляется с помощью метода хроматографии. Наиболее широко используют метод газожидкостной хроматографии. Ведущей областью применения метода являются идентифи­кация анаэробных бактерий по составу жирных кислот с короткой углеродной цепью (9—20 атомов углерода), относя­щихся к основным продуктам метаболизма этих микроорганиз­мов, а также идентификация медленно растущих бактерий (микобактерий) и бактерий с низкой ферментативной актив­ностью.

Молекулярно-генетические методы идентификации. Они ос­нованы на анализе бактериальных ДНК.

Рестрикционный анализ. ДНК обрабатывают рестрикционными ферментами — специфическими эндонуклеазами, которые разрезают молекулу ДНК по определенным по­следовательностям нуклеотидов. Далее проводят анализ полу­ченных фрагментов, уникальных для каждого вида микроорга­низма. Метод также позволяет осуществлять внутривидовое
типирование бактерий.

Гибридизация ДНК. Любой микроорганизм имеет в своем геноме определенные уникальные последовательности, которые могут быть использованы для его идентификации.
Метод обнаружения таких участков ДНК основан на способ­ности комплементарных последовательностей нуклеиновых кислот к гибридизации. Исследование проводят с помощью
нуклеиновых зондов — однонитевых фрагментов ДНК, ком­плементарных уникальным участкам микробного генома и не­сущих метку (радионуклид, фермент или флюорохром). Вклю­чение метки обеспечивает высокую чувствительность метода. В зависимости от выбранного генетического фрагмента зонды могут быть родо-, видо- или типоспецифическими. Быстрота
и высокая чувствительность метода гибридизации позволяют существенно сократить время исследования. Основной облас­тью применения является идентификация трудно культивиру­емых или медленно растущих микробов (например, представи­телей родов Mycobacterium, Neisseria, Campy lobacter). Особо сле­дует выделить метод риботипирования — идентификации, осно­ванной на анализе генов, кодирующих рибосомальные РНК.

Полимеразная цепная реакция (ПЦР). Метод ПЦР позволяет обнаруживать уникальные последовательности ДНК, присутствующие в образце в очень малых количествах.
Теоретически достаточно одной копии искомой последователь­ности. Метод ПЦР основан на амплификации (увеличении числа копий) искомого участка генома микроорганизма. С этой целью образец инкубируют в буферном растворе с двумя ко­роткими ДНК-олигомерами (праймерами), комплементарны­ми концам известного фрагмента генома, термостабильной ДНК-полимеразой и нуклеотидами. После гибридизации олигомеров с комплементарными участками ДНК они служат праймерами для полимеразы, которая копирует искомый фраг­мент. Образец многократно нагревают для разделения цепей двойной спирали ДНК и остужают для повторной гибридиза­ции праймеров с комплементарной матрицей. Каждая копия ДНК становится новой матрицей для синтеза новой копии. Процедуру повторяют 20—40 раз. При этом количество копий искомого фрагмента генома увеличивается по экспоненциаль­ному закону. Амплификация в миллионы раз занимает всего несколько часов.

Глава 4

МОРФОЛОГИЯ И ФИЗИОЛОГИЯ ГРИБОВ

Введение. Грибы представляют собой многочисленную груп­пу микроорганизмов, относящихся к доминиону Eukarya, цар­ству Mycota. Классификация внутри царства основана на мор­фологии, характере и способах размножения, физиологических особенностях и других признаках. Клетка гриба имеет ультра­структуру, типичную для эукариот. Все грибы способны к бесполому размножению, совершенные грибы могут также раз­множаться половым путем. Представители одного вида в по­ловой (телеоморфной) и бесполой (анаморфной) фазах разви­тия могут существенно различаться по морфологии, экологии и в случае патогенных видов способности вызывать заболева­ния. Грибы подразделяются на две основные морфологические группы: плесени (нитевидные грибы) и дрожжи.

Морфология плесневых грибов. Вегетативное тело плесневого гриба — гифа — имеет нитевидную форму. Толщина гиф обыч­но превышает 2 мкм, что позволяет отличить их от актиноми-цетов, толщина клеток которых не превышает 1 мкм. Длина гиф у свободно живущих видов может достигать нескольких метров. У высших грибов гифа разделена мембранными пере­городками — септами, у низших септы отсутствуют. Гифы в процессе развития ветвятся и образуют анастомозы, за счет чего формируется переплетенная структура — мицелий. Разли­чают субстратные гифы (мицелий), погруженные в питатель­ный субстрат, и воздушные, растущие над его поверхностью.

параты раздавленная" капля из чистых культур гри­бов родов Penicillium, Aspergillus, Mucor.

Питательные среды для культивирования грибов.

Рост и типы филаментации дрожжеподобных грибов рода Candida на картофельном агаре.

Изучение биохимических признаков чистой культуры грибов рода Candida ("пестрый ряд").

Задание студентам

Микроскопировать и зарисовать мазки, предложен­ные для демонстрации.

Ознакомиться с таблицами.

Описать характер роста грибов рода Candida на глюкозокартофельном агаре. Указать тип филаментации (по данным таблицы "Бластоспоры и филаментация дрожжеподобных грибов").

Проанализировать "пестрый ряд" чистой культуры грибов рода Candida, сверяя полученные результаты с данными таблицы "Таксономические признаки дрож­жеподобных грибов рода Candida", и сделать заклю­чение о видовой принадлежности.

а Методические указания

Морфологию грибов изучают в нативных и фиксированных препаратах. Для приготовления нативного препарата "раздав­ленная капля" для изучения морфологии плесневых грибов отделяют препаровальными иглами небольшой участок мице­лия с плодоносящими гифами и прилегающим к нему тонким слоем питательной среды. Материал помещают в каплю воды на предметном стекле, иглой расправляют мицелий, придавли­вают покровным стеклом и микроскопируют при опущенном конденсоре. Препарат просматривают с объективом 8х, а затем — 40х. Предварительно колонии или культуры грибов микроскопируют непосредственно на чашках или в пробирках под малым увеличением.

Методы культивирования грибов аналогичны бактериологи­ческим. Грибы выращивают на специальных сложных пита­тельных средах (среда Сабуро, сусло-агар, картофельные, мор­ковные среды и др.), включающих углеводы в качестве источ­ника энергии и углерода и различные факторы роста. Для приготовления таких сред обычно используют натуральные добавки: дрожжевой экстракт, пивное сусло, овощные экстра­кты и др. Для задержки роста бактерий добавляют антибиотики и/или молочную кислоту.

Среда Сабуро состоит из дрожжевой воды с добавлением 1 % пептона, 2 % агара и 4 % мальтозы (или глюкозы). Питатель­ную среду разливают в пробирки и стерилизуют при 0,5 атм в течение 20 мин. В жидкие среды агар не добавляют.

Этапы выделения чистых культур грибов (из организма больного или объектов внешней среды) те же, что и при выделении бактерий. Исследуемый материал засевают на спе­циальные жидкие обогатительные (для накопления в случае малой концентрации микроорганизмов) или плотные питатель­ные среды для получения изолированных колоний и инкуби­руют в термостате при температуре 37^е и 28—30 'С в течение нескольких дней. Рост грибов наблюдается на 3—5-е сутки. На плотных средах формируются разнообразные колонии: плос­кие, выпуклые, гладкие, морщинистые, мучнистые, слизистые, пушистые и др., часто пигментированные. Так, дрожжеподоб-ные грибы рода Candida на 2—3-й день после посева образуют мелкие выпуклые пигментированные колонии с гладкой блес­тящей поверхностью, которые нередко сливаются и врастают в питательную среду. Делают пересев колоний, выделяют чис­тую культуру и проводят идентификацию с определением ро­довой и видовой принадлежности на основании морфологи­ческих, культуральных, биохимических и других признаков. Методы идентификации грибов аналогичны методам иденти­фикации бактерий. Особое значение для определения видовой принадлежности чистой культуры плесневых грибов имеет изу­чение их морфологии. Для определения культуральных призна­ков колонии грибов микроскопируют непосредственно на чаш­ках или в пробирках под малым увеличением. Биохимические свойства можно определить с помощью "пестрого ряда" или другими методами (см. тему 3.2).

Глава 5

ОБЛИГАТНЫЕ ВНУТРИКЛЕТОЧНЫЕ ПАРАЗИТЫ

Введение. К облигатным внутриклеточным паразитам отно­сятся все вирусы и некоторые бактерии (представители поряд­ков Chlamydiales и Rickettsiales), а также ряд видов патогенных простейших (Toxoplasma, Plasmodium и др.). Вирусы выделены в самостоятельное царство Vira. Вирусы не имеют клеточного строения, собственного метаболизма, содержат один тип нук­леиновой кислоты — ДНК или РНК, не размножаются бинар­ным делением и могут кристаллизоваться как неорганические вещества. Они являются облигатными внутриклеточными па­разитами с дизъюнктивным (разобщенным) типом размноже­ния. Внеклеточная форма существования вируса называется вирионом. В отличие от организмов, имеющих клеточное строе­ние, вирусы занимают промежуточное положение между живой и неживой материей. В основе классификации вирусов лежат определенные признаки:

тип вирусной нуклеиновой кислоты — ДНК-содержащие и РНК-содержащие;

тип симметрии капсида — изометрический (кубический), спиральный или смешанный;

наличие или отсутствие суперкапсида — просто или сложно устроенные;

тип хозяина — вирусы человека и животных, растений, бактерий (бактериофаги).

Тема 5.1. МОРФОЛОГИЯ И СТРУКТУРА ВИРУСОВ. ВИРУСОСКОПИЧЕСКИЕ МЕТОДЫ ИССЛЕДОВАНИЯ

Введение. Вирион состоит из сердцевины (нуклеиновой кис­лоты в комплексе с сердцевинными белками) и оболочек. Размеры вирионов колеблются от 15—20 (0,015—0,002 мкм) до 300-500 нм (0,3-0,5 мкм).

Существуют простые и сложные вирионы. Первые снабже­ны только капсидом. Форма просто устроенных вирусов опре­деляется типом симметрии его капсида: изометрическим или спиральным. У вирусов с изометрическим типом симметрии капсида отдельные морфологические субъединицы капсида (капсомеры) уложены на осях симметрии многогранника, на­пример икосаэдра (двадцатигранника). При этом вирион при­обретает сферическую форму. У вирусов со спиральным типом симметрии капсомеры уложены по спирали вокруг нуклеино­вой кислоты. При этом вирион приобретает палочковидную форму.

Сложные вирионы имеют дополнительную внешнюю обо­лочку — суперкапсид, покрывающий капсид снаружи. Супер-капсид представляет собой модифицированную мембрану клет­ки хозяина [цитоплазматическую (ЦПМ), ядерную или др.], содержащую вирусные белки и гликопротеины. Форма слож­ных вирусов обычно близка к сферической, для них характерен плеоморфизм.

Вирусы бактерий (бактериофаги) имеют сперматозоидную или нитевидную форму. Бактериофаги сперматозоидной фор­мы состоят из головки, в которой содержится нуклеиновая кислота, и отростка. Капсид головки фагов построен по изо­метрическому типу симметрии, а отростка — по спиральному. У некоторых фагов отросток очень короткий или может отсут­ствовать.

Морфологию вирусов изучают с помощью электронной микроскопии. Методы сканирующей электронной микроско­пии позволяют исследовать форму и характер поверхности вирусной частицы. Для изучения ультраструктуры вирусов применяют методы просвечивающей электронной микроско­пии.

Тема 5.2. КУЛЬТИВИРОВАНИЕ ВИРУСОВ И ДРУГИХ ОБЛИГАТНЬГХ ВНУТРИКЛЕТОЧНЫХ ПАРАЗИТОВ (РИККЕТСИЙ, ХЛАМИДИЙ)

Введение. Вирусы не имеют собственного метаболизма. Для репродукции они используют метаболические системы клетки-хозяина.

Различают 3 типа взаимодействия вируса с клеткой.

Продуктивная инфекция. При этой форме инфек­ции в клетке происходит репродукция вируса и образуется вирусное потомство — 10⁴—10^ вирусных частиц, которые вы­
ходят из зараженной клетки во внешнюю среду.

Интегративная инфекция. Геном вируса встраива­ется (интегрирует) в геном клетки-хозяина. Интегрированные вирусные геномы — провирусы — передаются потомству зара­женной клетки при делении. РНК-содержащие вирусы также могут вызвать интегративную нфекцию путем обратной транскрипции с помощью РНК-зависимой ДНК-полимеразы
(обратной транскриптазы). При этом в клеточный геном встра­ивается образующаяся ДНК-копия вирусной РНК. При опре­деленных условиях интегративная форма вирусной инфекции
может переходить в продуктивную.

Абортивная инфекция. При проникновении в клетку дефектного вируса, не способного к самостоятельной репро­дукции, или при попадании полноценного вируса в непермис-
сивную (не подходящую для его репродукции) клетку, или при неподходящих условиях внешней среды возникает абортивная форма инфекции. Взаимодействие с клеткой прерывается на одной из ранних стадий — вирус не репродуцируется и не передается потомству зараженной клетки.

План

Программа

Методы культивирования вирусов, риккетсий, хламидий.

Методы индикации вирусов.

Бактериофаги: морфология и физиология, практичес­кое применение.

Демонстрация

Питательные среды, растворы и лабораторная посуда для культур клеток.

Культуры клеток: незараженные, зараженные вирусом простого герпеса и хламидиями. Отметить изменения в культурах клеток, зарисовать, сделать вывод.

Задание студентам

1. Учесть результаты реакции гемагглютинации (РГА), поставленной для выявления гемагглютинирующего

вируса в материале из куриного эмбриона, и опреде­лить титр вируса.

Учесть результаты индикации вируса в культуре кле­ток по цветной пробе.

Учесть результат титрования бактериофага по методу Грациа.

Определить спектр литического действия бактерио­фага.

Ознакомиться с методом фаготипирования бактери­альных культур. Определить фаговары культур стафи­лококков, выделенных от больных.

Ознакомиться с препаратами бактериофагов, классифицировать по назначению.

а Методические указания

Методы культивирования вирусов. Для культивирования ви­русов используют культуры клеток, куриные эмбрионы и чув­ствительных лабораторных животных. Эти же методы приме­няют и для культивирования риккетсий и хламидий — облигатных внутриклеточных бактерий, которые не растут на ис­кусственных питательных средах.