Определение антимикробного действия антисептических и дезинфицирующих средств. 1. Подготовить два вида тест-объектов: а) шелковые нити, смоченные культурой E.coli; б) шелковые нити, смоченные спорообразующей культурой (с большим содержанием спор). Нити поместить в растворы фенола (5 %), лизола (5 %), хлорной извести (10 %) на 5 и 60 мин, после чего отмыть от исследуемых веществ, засеять в питательный бульон и поместить в термостат до следующего дня. Контрольные пробы действию химических веществ не подвергать. Отметить результат поставленного опыта и сделать заключение.
2. Диски из фильтровальной бумаги смочить растворами исследуемых веществ и поместить на поверхность питательного агара в чашке Петри, засеянной (газоном) тест-культурой стафилококка или кишечной палочки. Чашку инкубировать в течение суток при 37 °С. Об антибактериальном действии исследуемых веществ судят по диаметру зон задержки роста бактерий, образующихся вокруг дисков.
Тема 7.2. МЕТОДЫ ОЦЕНКИ ЭФФЕКТИВНОСТИ ДЕЙСТВИЯ АНТИМИКРОБНЫХ ПРЕПАРАТОВ
Введение. Антимикробные препараты (природные и синтетические антибиотики) используются для лечения заболеваний, вызванных микроорганизмами. Для эффективной терапии необходим подбор препарата, обладающего наибольшей активностью по отношению к данному возбудителю инфекции и оказывающего наименьший вред нормальной микрофлоре человека. Широкое распространение бактериальных штаммов, обладающих различной степенью устойчивости ко многим препаратам (поли-резистентностью), делает особенно актуальными качественную (метод дисков) и количественную (метод серийных разведений) оценку чувствительности бактерий к лечебным препаратам.
План
Программа
Спектры действия основных групп антимикробных препаратов.
Оценка действия на бактерии антимикробных препаратов методом дисков.
Определение минимальной ингибирующей концентрации (МИК) антимикробных препаратов методом серийных разведений.
Демонстрация
1. Антимикробные препараты различных групп.
77
Стандартные бумажные диски, пропитанные антимикробными препаратами, для определения чувствительности к ним бактерий.
Таблицы и схемы антимикробных спектров важнейших групп антибиотиков и механизмы их антибактериального действия.
Задание студентам
Поставить опыт по определению чувствительности стафилококков к различным антибиотикам методом дисков.
По результатам поставленного опыта определить минимальную ингибирующую концентрацию пенициллина для различных бактериальных культур методом серийных разведений.
Методические указания
Количественное определение чувствительности бактерий к антимикробным препаратам методом серийных разведений. Данный метод применяют для определения минимальной подавляющей концентрации (МПК) — наименьшей концентрации антибиотика, полностью подавляющей рост исследуемых бактерий. Готовят основной раствор антибиотика, содержащий препарат в определенной концентрации (мкг/мл или ЁД/мл) в физиологическом или буферном растворе или в специальном растворителе. Основной раствор используют для приготовления серийных (2-кратных) разведений антибиотика в питательной среде — бульоне (в объеме 1 мл) или агаре. Из исследуемой бактериальной культуры готовят суспензию стандартной плотности и засевают по 0,1 мл на среды с разной концентрацией антибиотика, а также на среду без препарата (контроль культуры). Посевы инкубируют при 37 °С 20—24 ч или более (для медленно растущих бактерий), после чего отмечают результаты опыта по помутнению питательного бульона или появлению видимого роста бактерий на агаре, сравнивая с контролем. Наименьшая концентрация антибиотика, полностью подавляющая рост исследуемой культуры, принимается за МПК.
|
Метод серийных разведений может быть использован для определения чувствительности к антибиотикам любых микроорганизмов, включая прихотливых и медленно растущих, а также облигатных внутриклеточных паразитов (хламидий, риккетсий и вирусов). В последнем случае антимикробные препараты в различных концентрациях добавляют в среду для культивирования клеток, после чего клетки заражают чистой культурой тестируемого вируса или бактерии. Результат оценивают по ЦПД или с помощью серологических реакций, позволяющих обнаружить накопление антигенов возбудителя в зараженных клетках (см. главу 10). Чаще всего с этой целью применяют иммунофлюоресцентный метод (ИФ). Наимень-Антибиотик МПК (мкг/мл) чувстви- промежу- устой-тельные точные чивые (S) (I) (R) Пенициллины Бензилпенициллин: • для стафилококков <0,12 — >0,25 • для других бактерий <1,5 >1,5 Оксациллин • для Staphylococcus aureus <2 — >4 • для других видов стафилококков <0,25 — >0,5 Метициллин <2 — >4 Ампициллин: • для стафилококков <0,25 — >0,5 • для E.coli и других энтеробактерий <8 16 >32 Карбенициллин: • для E.coli и других энтеробактерий <16 32 >64 • для Pseudomonas aeruginosa <128 256 >512 Пиперрациллин • для E.coli и других энтеробактерий <16 32 >64 • для Pseudomonas aeruginosa >64 — >182 Азлоциллин <64 — >128 Цефалоспорины Цефазолин <8 16 >32 Цефалотин <8 16 >32 Цефаклор <8 16 >32 Цефалексин <8 16 >32 Цефуроксим <8 16 >32 |
|
Антибиотик МИК (мкг/мл) чувстви- промежу- устой-тельные точные чивые (S) (I) (R) Цефамандол <8 16 >32 Цефотаксим <8 16—32 >64 Цефтриаксон <8 16—32 >64 Цефоперазон <16 32 >64 Цефтазидим <8 16 >32 Цефепим <8 16 >32 Новые бета-лактамы Имипенем <4 8 >16 Меропенем <4 8 >16 Хинолоны Налидиксовая кислота ^16 — >32 Ципрофлоксацин <1 2 >4 Офлоксацин <2 4 >8 Норфлоксацин <4 8 >16 Аминогликозиды Канамицин <16 32 >64 Гентамицин <4 8 >16 Тобрамицин <4 8 >16 Амикацин <16 32 >64 Нетилмицин <8 16 >32 Тетрациклины, макролиды, линкозамиды Тетрациклин <2 4—8 >1б Доксициклин ^4 8 >16 Эритромицин <0,5 1—4 >8 Азитромицин <2 4 >8 Кларитромицин <2 4 >8 Алеандомицин <2 >8 Линкомицин <2 4 >8 Клиндамицин <0,25 0,5 >1 Антибиотики других групп Хлорамфеникол (левомицетин) <8 16 >32 Фузидиевая кислота <2 4—8 >16 Рифампицин <2 4 >8 Полимиксин <50 ЕД/мл >:50 ЕД/мл Ванкомицин <4 8—16 >32 Фурадонин ^32 64 2:128 |
Микротест-системы для определения чувствительности к антимикробным препаратам. Микротест-системы предназначены для быстрого определения клинической чувствительности к антибиотикам бактерий определенных видов или родственных групп. Тестируемые препараты в стандартных концентрациях находятся в лунках готовых пластиковых планшетов. Определяют чувствительность исследуемой культуры к двум концентрациям каждого антибиотика: средней терапевтической и максимальной. Материал из изолированной колонии с помощью мерной бактериологической петли (объем 1 мкл) вносят в 5 мл стандартной питательной среды, содержащей индикатор, и готовят суспензию. Готовую бактериальную суспензию разливают в лунки планшета по 0,1 мл и инкубируют при оптимальных для данного вида бактерий условиях температуры и газового состава среды. О росте бактерий судят по изменению цвета индикатора, что позволяет существенно сократить сроки исследования. Если бактерии сохраняют жизнеспособность в присутствии антибиотика, выделение продуктов метаболизма приводит к изменению цвета индикатора. Отсутствие изменения цвета свидетельствует о полном подавлении жизнедеятельности микроба. Результаты определяют через 4 ч инкубации с помощью спектрофотометра.
Определение клинической чувствительности бактерий к антимикробным препаратам методом дисков (диффузионный тест). Метод основан на подавлении роста бактерий на плотной питательной среде под действием антибиотика, содержащегося в бумажном диске. В результате диффузии препарата в агар вокруг диска образуется градиент концентрации антибиотика. Размер зоны подавления роста зависит от чувствительности бактерии и свойств препарата (в частности, скорости диффузии в агаре). Для определения чувствительности в клинической практике применяют готовые стандартные диски со строго определенным содержанием антибиотиков. Содержание препарата определяется исходя из терапевтических концентраций каждого антибиотика и средних значений МПК для патогенных бактерий. Название препарата и его количество обозначено на каждом диске. Для определения чувствительности из исследуемой бактериальной культуры готовят взвесь, содержащую стандартное количество жизнеспособных клеток, и засевают газоном в чашки Петри (диаметр 100 мм) на среды Мюллера-Хинтон или АГВ (специальные среды, не препятствующие диффузии антимикробных веществ и не оказывающие на них негативного воздействия). Диски на засеянную поверхность накладывают с помощью аппликатора на расстоянии 2,5 см от центра чашки по кругу (рис. 7.2.1). На чашку помещают не более 5 дисков. Посевы инкубируют 18—20 ч при 35 °С. При корректном выполнении процедуры на фоне равномерного бактериального газона вокруг дисков образуются
|
Антибиотик Диаметр зоны задержки роста (мм) чувстви- промежу- устой-тельные точные чивые (S) (I) (R) Пенициллины Бензилпенициллин: • при испытании стафилококков £20 21—28 >29 • при испытании других бактерий £10 11—16 £17 Ампициллин: • при испытании стафилококков £20 21—28 £29 • при испытании грамотрицатель-ных бактерий и энтерококков <9 10—13 >14 Карбенициллин (25 мкг) <14 15—18 >19 Карбенициллин (100 мкг) при испытании P. aeruginosa <11 12—14 £15 Метициллин £13 14—18 £19 Оксациллин (10 мкг) £15 16—19 £20 Азлоциллин (для P. aeruginosa} £13 14—16 £16 Пиперациллин (для P. aeruginosa) <17 — >18 Азтреонам <15 16—21 >22 Цефалоспорины Цефалотин £14 15—18 £19 Цефазолин <14 15—18 >19 Цефуроксим £14 15—18 >19 Цефокситин <14 15—18 £19 Цефотаксим <14 15—20 >21 Цефтриаксон £14 15—20 £21 Цефоперазон £14 15—18 £19 Цефтазидим £14 15—17 £18 Цефалексин £14 15—18 £19 Цефаклор £14 15—18 £19 Цефиксим £15 16—19 £20 Цефепим* <14 15-17 £18 |
|
Антибиотик Диаметр зоны задержки роста (мм) чувстви- промежу— устой -тельные точные чивые (S) (I) (R) Новые бета-лактамы Имипенем* <13 14—15 >16 Меропенем* <13 14—15 >16 Хинолоны Ципрофлоксацин <15 16—20 >21 Офлоксацин <12 13—16 >17 Налидиксовая кислота* <12 13—17 >18 Аминогликозиды Стрептомицин <16 17—19 >20 Канамицин <14 15—18 >19 Гентамицин <15 — >16 Сизомицин <15 — £16 Тобрамицин <14 — >15 Амикацин <14 15—16 >17 Нетилмицин <12 13—14 >15 Тетрациклины, макролиды, линкозамиды Тетрациклин <16 17—20 >22 Доксициклин <15 16—19 >20 Эритромицин <17 18—21 >22 Азитромицин <13 14—17 >18 Рокситромицин* <14 15—18 >19 Кларитромицин* <13 14—17 >18 Линкомицин <19 20—23 >24 Клиндамицин <14 15—20 >21 Олеандомицин <16 17—20 >21 Антибиотики других групп Хлорамфеникол <15 16—18 >19 Фузидиевая кислота <16 17—20 >21 Рифампицин <12 13—15 >16 Полимиксин <11 12—14 >15 Ванкомицин: • для стафилококков <11 — >12 • для энтерококков <14 15—16 >17 Ристомицин <9 10—11 >12 Фурадонин <15 16—18 >19 Фурагин <15 16—18 >19 |
|
Номер Разведение антибиотика Концентрация Рост бактерий пробирки антибиотика, (помутнение мкг/мл среды) 1 1:100 100 -2 1:200 50 -3 1:400 25 -4 1:800 12,5 -5 1:1600 6,25 + 6 1:3200 3,12 + 7 Среда без антибиоти- — + ка (контроль) |