Материал: Тец руководство

В микробиологической лаборатории все остатки патологического материала подлежат уничтожению (путем автоклавирования).

Все материалы, направленные в лабораторию, должны иметь сопроводительный документ — направление на специальном бланке, где указаны фамилия, имя, отчество больного,
возраст, вид материала, дата взятия, предполагаемый клини­ческий диагноз и другие сведения.

• МЕТОДЫ КЛИНИКО-ДИАГНОСТИЧЕСКИХ МИКРОБИО­ЛОГИЧЕСКИХ ИССЛЕДОВАНИЙ

• Методы обнаружения возбудителя в материале от больного

Для обнаружения возбудителя в материале от больного с диагностической целью применяют:

микроскопические (бактериоскопические, микоскопические, вирусоскопические) методы;

микробиологические (бактериологические, микологичес­кие, вирусологические) методы;

биологические методы, или биопробы.

1. Микроскопические методы. Микроскопические методы применяют для обнаружения возбудителей (бактерий, грибов, простейших, вирусов) непосредственно в исследуемом мате­риале.

Для выявления бактерий (бактериоскопические ис­следования), а также грибов и простейших применяют све­товые методы микроскопии окрашенных или нативных пре­паратов, приготовленных из материала, полученного от боль­ного (см. тему 1.1 и главу 2).

Преимущество микроскопических исследований состоит в быстроте (осуществление требует не более 30—60 мин), про­стоте и дешевизне. Основным недостатком метода является низкая специфичность — невозможность видовой идентифика­ции обнаруженных микроорганизмов, а в ряде случаев — их дифференциации между собой (например, эшерихий, сальмо­нелл и шигелл). Чувствительность также невысока: микроско­пический метод позволяет обнаружить возбудителя при его концентрации не менее 10⁶ микробных клеток в 1 мл или 1 г исследуемого материала.

В большинстве случаев микроскопический метод имеет ори­ентировочное значение и позволяет получить предварительные данные о микробах, присутствующих в материале, и наметить пути дальнейших исследований. Вместе с тем при некоторых бактериальных инфекциях, а также при микозах и протозойных инфекциях диагностическая ценность микроскопического исследования весьма велика и является основанием для поста­новки окончательного диагноза заболевания, например воз­вратного тифа, гонореи, дерматомикозов и др.

Необходимо помнить, что некоторые бактерии (хламидии, микоплазмы) имеют малые размеры, лежащие за пределами разрешающей способности световой микроскопии, и не могут быть выявлены с помощью этих методов.

Вирусоскопические исследования осуществляют с использованием электронной микроскопии (по причине малых размеров вирусов, см. тему 5.1). В сочетании с компьютерными системами анализа изображений эти методы позволяют осу­ществлять предварительную идентификацию вирусов по мор­фологии. К числу достоинств метода относится также возмож­ность обнаружения ранее неизвестных вирусов. Чувствитель­ность метода аналогична бактериоскопическому.

Для диагностики инфекций, вызванных облигатными внут­риклеточными паразитами, применяют также цитологичес­кие методы, направленные на выявление характерного ЦПД в зараженных клетках, например внутриклеточных включе­ний — телец Бабеша—Негри при бешенстве, телец Пашена и Гварниери при оспе или цитомегалических клеток при заболе­ваниях, вызванных цитомегаловирусом (см. тему 5.2).

2. Микробиологические методы. Основаны на выделении чистой культуры возбудителя из материала, полученного от больного, и ее последующей идентификации (см. главу 3). Микробиологические методы отличаются высокой чувстви­тельностью и специфичностью. Располагая чистой культурой возбудителя, можно определить его родовую и видовую при­надлежность и осуществить внутривидовое типирование, обна­ружить факторы вирулентности, а также определить чувстви­тельность к антибиотикам, что необходимо для рационального выбора этиотропной терапии.

Для эпидемиологического анализа вспышек инфекционных заболеваний проводят типирование культур возбудителей, вы­деленных от разных больных и из внешних объектов — веро­ятных источников заражения (вода, пищевые продукты и т.д.), т.е. определение их биовара: серовара (серотипирование, см. тему 10.1), фаговара (фаготипирование, см. тему 5.3) и т.д. Кроме того, микробиологические исследования проводят для выявления носительства патогенных микробов среди детей и взрослых, а также среди работников медицинских учреждений, предприятий пищевой промышленности и общественного пи­тания.

Бактериологическое исследование является ведущим в диагностике большинства бактериальных инфекций. Труд­ности метода могут быть связаны с низкой скоростью размно­жения бактерий-возбудителей, сложными ростовыми потребностями и требовательностью к условиям культивирования (га­зовому составу атмосферы и т.д.). Однако только выделение чистой культуры возбудителя из материала от больного при исключении контаминации имеет абсолютное диагностическое значение.

Микологические исследования осуществляют реже, чем бактериологические, поскольку микроскопическая диа­гностика микозов достаточно надежна. Микологические иссле­дования являются обязательными при диагностике кандидозов, а также глубоких микозов.

Вирусологический метод является наиболее достовер­ным для диагностики вирусных инфекций. Однако его приме­нение ограничивается трудоемкостью, что связано с особен­ностями хранения, транспортировки и обработки исследуемого материала, использованием культур клеток, сложностью и дли­тельностью культивирования многих вирусов, а также со срав­нительно частым получением отрицательных результатов. Идентификацию чистой культуры выделенного вируса осу­ществляют иммунологическими методами на основании его антигенной структуры, а также в ряде случаев с помощью биохимических и молекулярно-биологических методов (гибри­дизация НК, рестрикционный анализ и др., см. тему 3.2). Особое значение вирусологический метод приобретает в случае необходимости оценки чувствительности возбудителя к проти­вовирусным препаратам. В ряде случаев вирусологический ме­тод используют для ретроспективной диагностики вирусных инфекций.

Все микробиологические методы имеют определяющее зна­чение в лабораторной диагностике инфекционных заболева­ний, являются наиболее информативными и достоверными. К числу недостатков можно отнести длительность (см. главу 3) и отсутствие методов культивирования некоторых микробов (например, возбудителей сифилиса и лепры).

3. Биологические методы (биопробы). Биопробу осуществля­ют путем заражения лабораторных животных материалом, по­лученным от больного. Этот метод применяют для выделения чистой культуры возбудителя в тех случаях, когда микроорга­низмы не растут или плохо культивируются, когда микробио­логические методы не дают однозначно положительного ре­зультата, а также для дифференциации патогенных микроор­ганизмов и определения их вирулентности. Дифференциация возбудителей основана на неодинаковой чувствительности раз­ных лабораторных животных к определенным микроорганиз­мам. В настоящее время биопробы применяют только в случае крайней необходимости, что определяется в первую очередь гуманным отношением к животным, а также связано с повы­шенным риском заражения персонала диагностической лабо­ратории.

• Иммунохимические методы диагностики: (методы обнару­жения антигенов возбудителя в материале от больного)

1. Метод иммунофлюоресценции (ИФ). Дает возможностьобнаружить в материале от больного антигены микроба с по­мощью специфических антител, меченных флюорохромами
(см. тему 10.1). Этот метод позволяет выявлять и идентифици­ровать по антигенной структуре возбудителей в материале, содержащем разнообразную микрофлору (например, в испраж­
нениях), а также обнаруживать вирусные антигены в заражен­ных клетках. В настоящее время иммунофлюоресцентный ме­тод широко применяют для обнаружения разнообразных мик­
роорганизмов в патологическом материале.

Иммуноэлектронная микроскопия (ИЭМ). Позволяет зна­чительно повысить чувствительность и специфичность вирусоскопического метода. Исследуемый материал, содержащий
свободные вирусные частицы, обрабатывают специфическими антителами. Образовавшиеся иммунные комплексы осаждают высокоскоростным центрифугированием и агрегаты вирусных
частиц выявляют с помощью электронной микроскопии. Су­ществуют также твердофазные методы ИЭМ: специфические антитела фиксируют на специальных сетках для ЭМ, которые
затем обрабатывают исследуемым материалом. Вирусные час­тицы специфически связываются с антителами, после чего их выявляют с помощью электронной микроскопии. В ряде слу­чаев применяют антитела, меченные частицами золота (см. тему 10.1).

Другие серологические реакции. Растворимые антигены различных возбудителей (компоненты микробных клеток, вирионов, неструктурные вирусные белки, секретируемые зара­женными клетками, бактериальные экзотоксины и ферменты и т.д.) могут быть обнаружены в различных биологических жидкостях больного с помощью серологических реакций. Наи­более часто применяют иммуноферментный (ИФА) и радио­ иммунный (РИА) анализ в связи с их высокой чувствительнос­тью, реже используют методы преципитации в геле и непрямой агглютинации (см. тему 10.1).

• Биохимические и молекулярно-биологические методы диа­гностики

1. Метод газожидкостной хроматографии (ГЖХ). Позволяет разделять сложные смеси органических соединений. Метод используют для обнаружения продуктов жизнедеятельности микроорганизмов в исследуемом материале (летучих жирных кислот, спиртов, нелетучих органических кислот и т.д.). Прин­цип метода основан на различной скорости движения соеди­нений, растворенных в инертном газе (подвижной фазе), через разогретую колонку, заполненную жидкими смолами (неподвижная фаза). На выходе колонки имеется детектор, регистри­рующий присутствие соединения. Идентификацию веществ производят путем сравнения со стандартами.

2. Методы обнаружения нуклеиновых кислот возбудителя. Ну­клеиновые кислоты (НК) возбудителя можно обнаружить в исследуемом материале от больного с помощью методов гиб­ридизации НК (ДНК-зондов) и полимеразной цепной реак­ции — ПЦР (см. тему 3.2). Эти методы применяют преимуще- Ц ственно для обнаружения плохо- или некультивируемых воз­будителей, присутствующих в материале в малых количествах (ВИЧ, вирус гепатита В, М.tuberculosis и др.) в связи с их высокой чувствительностью: метод нуклеиновых "зондов" позволяет обнаруживать НК возбудителя в концентрации 10~¹⁰ г/мл; ПЦР теоретически позволяет обнаружить единич­ные копии НК. Метод "зондов" является высокоспецифич­ным. При использовании ПЦР существует высокая вероят­ность получения ложноположительной реакции, что требует квалифицированной интерпретации полученных результатов. Не­обходимо также помнить о возможности контаминации материа­ла посторонними НК. ПЦР рационально использовать в качестве экспресс-метода для постановки предварительного диагноза, нуждающегося в обязательном подтверждении с помощью других более достоверных диагностических исследований.

• Серодиагностика и аллергодиагностика

1. Серодиагностика. Метод основан на обнаружении антител в сыворотке крови больного и определении динамики их на­растания в ходе заболевания. Для серодиагностики применяют различные иммунологические реакции (агглютинации, связы­вания комплемента, непрямой гемагглютинации и др., см. тему 10.2). В качестве стандартных антигенов используют живые культуры микроорганизмов (бактерий, вирусов, грибов) или диагностикумы — убитые взвеси микроорганизмов или экстра­кты из них, полученные химическим путем.

Серодиагностические исследования часто проводят и для эпидемиологического анализа инфекционной заболеваемости. С этой целью определяют наличие специфических антител у здоровых лиц, что свидетельствует о перенесении ими инфек­ции или о контакте с соответствующим возбудителем. Кроме того, серологические реакции используют наряду с другими иммунологическими показателями для оценки эффективности вакцинопрофилактики.

При серодиагностических исследованиях необходимо учи­тывать диагностический титр обнаруженных антител, т.е. такое разведение исследуемой сыворотки, начиная с которого поло­жительная реакция имеет диагностическое значение. Более вы­сокую информативность дают серологические исследования парных сывороток крови больного, взятых в начале болезни и через разные промежутки времени в ходе ее развития. Диагнос­тическое значение имеет нарастание титра в 4 раза и более в динамике заболевания.

2. Аллергодиагностика. Кожно-аллергические пробы приме­няют для выявления гиперчувствительности к различного рода антигенам (аллергенам) при диагностике ряда инфекционных заболеваний (туберкулез, бруцеллез, туляремия и др.), а также различных неинфекционных аллергических состояний (атопии и др.).

Кроме того, используют методы аллергодиагностики in vitro, позволяющие оценить состояние специфической сенсибилиза­ции лейкоцитов крови в отношении определенного антигена, например реакция торможения миграции лейкоцитов (РТМЛ) в присутствии специфического антигена (см. тему 10.4).

• ПРАВИЛА БИОЛОГИЧЕСКОЙ БЕЗОПАСНОСТИ ПРИ РА­БОТЕ С ПАТОГЕННЫМИ МИКРОБАМИ

При работе с патологическим материалом, содержащим микробы, и особенно при культивировании патогенных мик­робов во избежание заражения персонала лаборатории необхо­димо соблюдать правила техники биологической безопасности. В зависимости от степени патогенности и контагиозности воз­будителей принято выделять четыре уровня биологической опасности и соответствующих мероприятий, необходимых для предупреждения заражения в лаборатории.

Первый уровень (работа с непатогенными микроорганиз­мами). Необходимо соблюдение стандартных правил (см. тему 1.1).

Второй уровень (работа с низковирулентными микроорга­низмами). К числу дополнительных правил и мероприятий относятся использование лабораторной одежды и защитных перчаток; обязательное обеззараживание всех загрязненных от­ходов; ограничение доступа в лабораторию. Для предотвраще­ния попадания микробов в воздух рабочего помещения выпол­нение механических манипуляций, сопряженных с высокой вероятностью распыления микроорганизмов, необходимо осу­ществлять в специализированных закрытых легкодезинфици­руемых настольных боксах.

Третий уровень (работа с высоковирулентными микроорга­низмами). К числу дополнительных правил и мероприятий относятся использование специальной защитной лабораторной одежды; контроль доступа в лабораторию. Все манипуляции с патологическим материалом необходимо осуществлять в спе­циализированных боксах.

Четвертый уровень (работа с возбудителями ООН). Работа с возбудителями особо опасных инфекций (ООН) разрешена ис­ключительно в специализированных режимных лабораториях, имеющих оборудование, необходимое для эффективной защи* ты от патогенных микробов, их контроля и уничтожения. К числу дополнительных правил и мероприятий относятся наличие отдельных помещений для смены лабораторной одеж­ды и душевых, обязательное обеззараживание всех отходов лаборатории. Все манипуляции с патологическим материа­лом необходимо осуществлять в специализированных на­стольных боксах, снабженных системами стерилизации возду­ха (см. тему 7.1).