Статья: Протеолитическая активность мицелиальной культуры гриба вешенка обыкновенная (Pleurotus ostreatus) при глубинном культивировании

Таблица 1. - Расщепление белков субстратов гомогенатами мицелия культуры вешенки при различной величине рН (« = 4)

Таблица 2. - Расщепление белков субстратов культуральной жидкостью культуры вешенки при различной величине рН (п = 4)

Гомогенат мицелия. Ингибитор сериновых протеиназ - диизопропилфторфосфат - угнетал желатинолитичекую активность мицелия при рН 5,0, 7,6, 8,0 и 8,4 на 45, 47, 38 и 52% соответственно, полностью подавляя ее при рН 10,6 (рисунок 2).

Рисунок 2. - Влияние группоспецифических ингибиторов: диизопропилфторфосфата (1), p-хлормеркурибензоата (2), пепстатина (3), ЭДТА (4), о-фенантролина (5), 8-гидроксихинолина (6) на желатинолитическую активность гомогенатов мицелия культуры вешенки обыкновенной при различной величине рН

Действие p-хлормеркурибензоата - груп- поспецифицеского ингибитора цистеиновых протеиназ было существенным лишь при рН и 10,6, где подавление желатинолиза составило 28 и 100% соответственно. Добавление к реакционной системе в диапазоне рН 5,0-5,8 группоспецифического ингибитора аспартильных протеиназ - пеп- статина сопровождалось сдвигами желатинолитической активности только в пределах 22%. Реагенты, связывающие катионы металлов, оказали разное действие в зависимости от их структуры и свойств и, как следствие, от свойств образующихся координационных комплексов. Так, ЭДТА, взаимодействующий преимущественно с двухвалентными катионами, умеренно угнетал желатинолиз при рН 5,0 и 8,4 - на 35 и 45% соответственно. о- фенантролин подавлял желатинолитическую активность при рН 5,8, 7,6 и 10,6 на 61, 33 и 100% соответственно. Ингибирующее действие 8-гидроксихинолина было отчетливо при рН 5,6, 8,0 и 10,6 - эффект составил 38, 33 и 34%.

Рисунок 3. - Влияние группоспецифических ингибиторов на казеинолитическую активность гомогенатов мицелия культуры вешенки обыкновенной Примечание - обозначения те же, что в рисунке 2

В отличие от этого выраженное ингибирующее действие диизопропилфторфосфата на казеинолитическую активность выявлено лишь при рН 7,6, оно достигало 100% (рисунок 3). Точно такой же эффект при этом рН характерен и для действия р- хлормеркурибензоата, тогда как при рН 8,2 он не превысил 38%. Пепстатин полностью подавлял казеино- лиз при рН 2,8 и 5,2. ЭДТА также полностью угнетал расщепление этого белка при рН 5,2, но умеренно стимулировал этот процесс при рН 2,8 и 7,6 - на 30 и 42% соответственно. культивирование вешенка ингибитор белок

Последнее может быть вызвано связыванием катионов металлов, ингибирующих казеинолитические энзимы. Это согласуется с тем, что в кислой среде о-фенантролин активировал казеинолиз в 2 раза. Добавление 8- гидроксихинолина сопровождалось полным подавлением активности казеинолитических протеиназ при рН 8,2 (рисунок 3).

При анализе изложенных данных, в первую очередь, примечательно полное подавление желатинолитической активности диизопропилфтрофосфатом, р-хлормеркурибензоатом и о-фенантролином при рН 10,6. По-видимому, желатинолитическая активность щелочных протеиназ реализуется сериновыми протеиназами, наделенными HS-группами и ионами металлов с переменной валентностью, значимыми для функционально активной конформации.

Желатинолиз в кислой среде (рН 5,0) лишь в малой степени обусловлен активностью «кислых» протеиназ типа аспартильных. Судя по отсутствию полного ингибирования желатинолитической активности диизопропилфторфосфатом при рН 5,0-8,4 (угнетение составило 40-60%), она лишь отчасти сопряжена с действием сериновых протеиназ. Примечательно, что желатинолитическая активность экстракта мицелия при рН 9,2 практически индифферентна ко всем использованным группоспецифическим ингибиторам. Это логически ставит вопрос о природе подобных желатиназ. В этом плане следует отметить, что и ранее при изучении протеолитической активности коммерческих образцов белков- ингибиторов протеиназ были получены результаты, не укладывающиеся в принятые представления об известных группах этих энзимов, Так, было показано, что фибринолитическая активность ингибитора трипсина из соевых бобов ^ВТГ) полностью блокировалась р-хлормеркурибензоатом, ЭДТА, этанолом и частично (на 44%) - стрептокиназой.

Сходные изменения наблюдались со стороны фибриногенолитической активности овомукоида (ОМ), но ингибирование было неполным, а эффект стрептокиназы отсутствовал. В отличие от SBTI и ОМ, протеолитическая активность овоингибитора (ОІ) по фибриногену и протамин-сульфату резко возрастала в присутствии стрептокиназы, а также при добавках этанола. Этанол-индуцированная фибринолитическая активность оказалась нечувствительна к фенилметилсульфонил- фториду, но полностью подавлялась офенантролином. Индуцированная же стрептокиназой активность угнеталась при добавках p-хлормеркурибензоата, ЭДТА, этанола. Однако протеолиз, инактивированный при добавках последнего, полностью восстанавливался в присутствии фенилметилсульфонилфторида. Более того, индуцируемая добавкой стрептокиназы протеолитическая активность ОІ не расщепляла хромогенный субстрат 8-2251 (H-D-Val-Leu-Lys-pNa) специфичный для плазмина [19].

Что касается казеинолитической активности, то есть все основания считать казеинолиз в кислой среде (рН 2,8 и 5,2) связанным с деятельностью «кислых» аспартильных протеиназ, по-видимому, содержащих функционально значимые ионы металлов. Однако, судя по различиям в изменениях активности при добавлении ЭДТА и о-фенантролина, протеиназы с оптимумами рН 2,8 и 5,2 содержат разные металлы.

Казеинолитическая активность экстрактов мицелия при рН 7,6 обусловлена протеиназами, имеющими Н8-группы и ионов металлов с переменной валентностью, значимыми для функционально активной конформации.

Культуральная жидкость. В отличие от гомогенатов мицелия, желатинолитическая активность культуральной жидкости при рН 5.8 полностью подавлялась диизопропил- фторфосфатом, но не была чувствительна к этому ингибитору при рН 7,6

Ингибирующее действие эффектора в щелочной среде (рН 8,4) было близко к таковому в случае гомогената мицелия - 64%. Действие ^-хлормеркурибензоата проявилось лишь при рН 5,8: в этом случае отмечено весьма умеренное (на 28%) угнетение желатинолитической активности. При этом значении рН желатинолиз слабо (на 20%) подавлялся в присутствии пепстатина (рисунок 4).

Рисунок 4. - Влияние группоспецифических ингибиторов на желатинолитическую (а) и казеинолитическую (б) активность культуральной жидкости культуры вешенки обыкновенной Примечание - обозначения те же, что в рисунке 2

Добавление в реакционную систему ЭДТА сопровождалось подавлением желатинолитической активности культуральной жидкости лишь при рН 8,4 - на 40%. Действие о-фенантролина отличалось от такового в случае гомогената мицелия: угнетение желатинолиза отмечено лишь при рН 5,8 и составило 47%. Этот эффектор не вызвал существенных изменений расщепления желатина культуральной жидкостью и при рН 7,6. Эффект 8-гидроксихинолина на желатинолтическую активность протеиназ культуральной жидкости при рН 8,4 существенно отличался от такового для гомогената мицелия. Здесь наблюдался рост желатинолиза на 40%.

Судя по результатам ингибиторного анализа, желатинолитическая активность экстрацеллюлярных протеиназ мицелиальной культуры вешенки при рН 5,8 всецело определяется сериновыми протеиназами, хотя при этом определенное значение имеют ионы металлов переменной валентности. В расщеплении же желатина в щелочной среде существенную роль играют также сериновые протеиназы. Однако в этом случае некоторую роль играют и другие протеолитические энзимы, нечувствительные к использованным группоспецифическим ингибиторам. Что же касается желатинолитической активности «нейтральных» протеиназ, то в данном случае мы наблюдали картину близкую таковой для внутриклеточных протеиназ с оптимумом активности при рН 9,2 (см. выше по тексту).

Казеинолитическая активность экстрацеллюлярных протеиназ при рН 8,2, в отличие от внутриклеточных энзимов, судя по результатам, полностью определяется сериновыми протеиназами.

Заключение

Изложенные материалы свидетельствуют о наличии в мицелии культуры вешенки развитого и разнопланового набора протеолитических энзимов, включающих сериновые, аспартильные протеиназы, и при этом в ряде случаев наделенных существенными для нативной конформации сульфгидрильными группами и ионами металлов. Менее представительный набор экстрацеллюлярных энзимов, судя по полученным данным, можно отнести к сериновым протеиназам.

Вместе с тем, обнаруживается в отдельных случаях протеолитическая активность, которую нельзя отнести по результатам ингибиторного анализа к сериновым, цистеиновым, аспартильным или металлопротеиназам. Подобные факты встречались и в ранее проведенных исслдеованиях на других объектах [19]

В последнее десятилетие среди протеолитических энзимов выделены группы треониновых и глутаминовых протеиназ, а также пептидаз смешанного каталитического типа[20]

Учитывая разнообразие видов живых организмов, не исключено, что в дальнейшем будут выделены и новые протеолитические энзимы, не относящиеся к перечисленным группам протеиназ.

Следует также отметить, что мицелиальная культура вешенки обыкновенной может служить богатым источником протеиназ для разных целей. Кроме того, логически поднимается вопрос о физиологической роли этого разнообразного арсенала протеолитических энзимов. Выяснение этой роли составляет объемную многоплановую самостоятельную задачу в перспективе.

Список литературы

1. Кудинов, П. И. Современное состояние и структура мировых ресурсов растительного белка / П. И. Кудинов, Т. В. Щеколди- на, А.С. Слизькая // Известия вузов. Пищевая технология. - 2012. - № 5-6. - С. 710.

2. Рождественская, Л. Н. Анализ вызовов и современных тенденций развития технологий на рынке белков / Л. Н. Рождественская, Е. С. Бычкова, А. Л. Бычков // Пищевая промышленность. -2018. - № 5. - С. 42-47.

3. Ritala, A. Single cell protein - state-of-the-art, industrial landscape and patents 2001-2016 / A. Ritala, S.T. Hдkkinen, M. Toivari, M.G. Wiebe // Frontiers in Microbiol. - 2017. - Vol. B. art. 2009. - P. 1-18.

4. Стахеев, И. В. Биотехнология малотоннажного производства микробного протеина / И. В. Стахеев, Э. И. Коломиец, Н. А. Здор // Минск: «Навука i тэхшка». - 1991. 264 с.

5. Jarvinen, R. Phisiological effect of Pekilo single cell protein in pigs / R. Jarvinen, R. Sa- vonen, A. Ahlstrom // Agricultural and Food Science. - 1980. - Vol. 52. - P. 14-23.

6. Wiebe, M.G. Use of a series of chemostat cultures to isolate 'improved' variants of the Quorn mycoprotein fungus, Fusarium gra- minearum A3/5 / M. G. Wiebe, G. D. Robson, S. G. Oliver, A. P. Trinci // Microbiology. - 1994. - 140 ( Pt 11). - Р. 3015-3021.

7. Wiebe, M. G. Mycoprotein from Fusarium venenatum: a well-established product for human consumption / M. G. Wiebe // Applied Microbiology and Biotechnology. - 2002. - № 58 (4). - P.421-427.

8. Бабицкая, В. Г. Pleurotus ostreatus - продуцент комплекса биологически активных веществ /В. Г. Бабицкая [и др.] // Прикладная биохимия и микробиология.- 1996. - Т. 32. - № 2. - С. 203-210.

9. Deepalakshmi, K. Pleurotus ostreatus: an oyster mushroom with nutritional and medicinal properties / K. Deepalakshmi, S. Mirunalini // Journal of Biochemical Technology. - 2014. Vol. 5. - No.2. -P. 718-726.

10. Dohmae, N. Purification and characterization of intracellular proteinases in Pleuro- tus ostreatus fruiting bodies / N. Dohmae, K. Hayashi, K. Miki, Y. Tsumuraya, Y. Hashimoto // Biosci. Biotech. Biochem. - 1995. - Vol. 59, No 11. - P. 2074-2080.