Полесский государственный университет
Протеолитическая активность мицелиальной культуры гриба вешенка обыкновенная (Pleurotus ostreatus) при глубинном культивировании
А.Д. Кульгавеня, аспирант
В.Н. Никандров, профессор кафедры биотехнологии
г. Пинск, Республика Беларусь
Аннотация
Протеиназы гомогената мицелия вешенки расщепляли желатин при рН 2,8-11,0 (максимум при 5,0-8,5 и 10,6), казеин - при рН 2,8-9,0 и гемоглобин - при рН 2,8-11,0. При концентрации группоспецифических ингибиторов 10-3 М желатинолитическая активность умеренно (на 38-61%) угнеталась диизопропилфосфатом и реагентами, связывающими металлы. Активность «щелочных» желатиназ полностью подавлялась диизопропилфторфосфатом, р-хлормеркурибензоатом и о-фенантролином. Казеинолитическая активность при рН 2,8 и 5,2 полностью угнеталась пепстатином, а при рН 5,2 - и ЭДТА. При рН 7,6 казеинолитическая активность полностью подавлялась диизопропилфосфатом и р-хлормеркурибензоатом. Желатинолитическая активность экстрацеллюлярных протеиназ проявилась при рН 3-11 (максимум при 5,8-10,6), их казеинолитическая активность - лишь при рН 7,6-8,2, а гемоглобинолитическая активность - в диапазоне рН 7,6-10,0 (максимум при 8,6-9,4).
Однако, судя по концентрации белка и по результатам ингибиторного анализа, желатинолитическая и казеинолитическая активность культуральной жидкости обусловлена, в основном, сериновыми протеиназами. Вместе с тем, желатинолитическая активность внутриклеточных протеиназ при рН 9,2 и экстрацеллюлярных протеиназ при рН 7,6 была слабо чувствительна к использованным в данном исследовании группоспецифическим ингибиторам. Это позволяет предположить существование протеиназиного типа.
Ключевые слова: протеиназы, мицелиальная культура, экстрацеллюлярные протеиназы, белки субстраты, рН-зависимость протеолиза, группоспецифические ингибиторы протеиназ
Abstract
Proteolytic activity of fungus pleurotus ostreatus mycelial culture in deep-liquid cultivation
Kulgavenya Alexandra D. Graduate Student
Nikandrov Vitaliy N., Doctor of Biol. Sc. Habil., Professor, Professor of the Department of Biotechnology.
Polessky State University, Pinsk, Republic of Belarus
It was stated that proteinases of Pleurotus mycelium homogenate cleaved gelatin at pH 2.8-11.0 (proteolysis maximums at 5.0-8.5 and 10.6), casein at pH 2.8-9.0 (maximums at 2.8, 4.0-5.0, and 6.2-8.2), and hemoglobin at pH 2.8-11.0 (maximums at 4.6-5.6 and 7.0-8.2). At 10-3 M concentration of group- specific inhibitors, gelatinolytic activity was moderately (38-61%) suppressed by diisopropylfluorophosphate and metal-binding reagents.
The activity of `alkaline ' gelatinases was completely suppressed by diisopropylfluorophosphate, p-chloromercuribenzoate, and o-phenanthroline. Caseinolytic activity at pH 2,8 and 5.2 was completely inhibited by pepstatin and at pH 5.2 - by EDTA.
At pH 7.6 the caseinolytic activity was completely suppressed by diisopropylfluorophosphate and p-chloromercuribenzoate. Gelatinolytic activity of extracellular proteinases appeared at pH 3-11 (proteolysis maximum at 5.810.6), their caseinolytic activity - only at pH 7.6-8.2, and hemoglobinolytic activity - in the range of pH 7.6-10.0 (maximum at 8.6-9.4).
However, judging by the protein concentration, the activity of extracellular proteinases exceeds that of intracellular enzymes in some cases by an order of magnitude.
According to the results of the inhibitory analysis, gelatinolytic and caseinolytic activities of the culture fluid are provided mainly by serine proteinases.
However, gelatinolytic activity of intracellular proteinases at pH 9.2 and extracellular proteinases at pH 7,6 was weakly sensitive to the class-specific inhibitors used in this study. This suggests the existence of some other type of proteinases.
Keywords: proteases, mycelial culture, extracellular proteases, protein substrates, pH-dependence of proteolysis, class-specific protease inhibitors
Введение
В последние десятилетия выявлен существенный дефицит белка в рационе питания населения. Нужно отметить также, что на кормовые, семенные и непищевые цели может направляться до 28% белка, потенциально пригодного в пищу человека. Кроме того, стоимость высококачественных животных белков непрерывно растет [1].
Нельзя не принять во внимание, что для огромного количества населения доступность животного белка резко ограничена (страны Африки, Южной Америки, Индия) и превалирующую часть их рациона составляют растительные белки. Дефицит белка четко проявил себя и в кормлении сельскохозяйственных животных. По данным экспертов проекта «Протеин России», недостаток кормовых белков составляет 770 тыс. тонн, а общий дефицит белков в России - 2 млн тонн/год.
Ликвидировать дефицит белка, лишь расширяя посевные площади или увеличивая поголовье скота, стало невозможно, что выдвигает проблему поиска альтернативных источников белка [2]. Подсчитано, что к 2050 году мировому сообществу потребуется 1.250 миллионов тонн мяса и молочных продуктов в год. Одним из альтернативных источников являются грибы, содержащие 30-50% белков с аминокислотным составом, сопоставимым с рекомендациями ФАО (FAO). Более того, грибы достаточно богаты витаминами, в первую очередь группы В, и целым рядом других биологически активных субстанций [3]. Следует отметить, что глубинное культивирование съедобных базидиальных грибов насчитывает уже более 70 лет. К числу объектов культивирования того времени относится и вешенка обыкновенная - Plerotus ostsreatus, хотя она и уступала некоторым другим грибам по содержанию белка в биомассе [4].
Грибной белок Pekilo, получаемый ферментацией мицелиальным грибом.
Paecilomyces varioti углеводов мелассы, молочной сыворотки, отходов фруктов, гидролизатов древесины или сельскохозяйственного сырья имеет хороший аминокислотный состав и богат витаминами. Pekilo-протеин - хороший источник белка в кормлении свиней, телят, бройлеров, кур-несушек и производится при непрерывном культивировании [5].
В Британии компания Ranks Hovis McDoudall и корпорация ICI поставляют на рынок грибной белок (mycoprotein), получаемый при выращивании гриба Fusarium на простых углеводах. Он производится для употребления в пищу людей также при непрерывной ферментации. Микопротеин хорошо переваривается [6, 7].
В нашей стране для употребления в пищу культивируют вешенку обыкновенную - Pleurotus ostreatus. Она отличается быстрым ростом и высоким выходом плодовых тел, обладает хорошими пищевыми качествами, содержит большое количество сбалансированного по аминокислотному составу белка, богата целым рядом ценных биологически активных веществ [8, 9]. По объему производства плодовых тел этот гриб занимает третье место в мире. Интенсификация технологии получения мицелия, обогащенного белками, настоятельно диктует необходимость уяснения биологии этого продуцента и, в частности, систем регуляции метаболизма и жизнедеятельности.
Одним из генеральных механизмов такой регуляции является протеолиз. О протеолитической системе вешенки данные мировой литературы весьма ограничены.
Из плодовых тел этого гриба выделены три протеиназы, проявляющие казеинолитическую активность при рН 5,6, при этом одна из них - сериновая протеиназа с функционально значимыми HS-группами, а две другие - Zn-содержащие металлоэнзимы [10]. Из культуральной жидкости при культивировании вешенки в жидкой питательной среде выделена экстрацеллюлярная сериновая суб- тилизин-подобная протеиназа, расщепляющая синтетические субстраты нитроанилид- ного, сложноэфирного плана и азоколлаген с оптимумом рН в щелочной зоне [11]. Была установлена и казеинолитическая активность протеиназ культуральной жидкости гриба с рН-оптимумом при 7,0 [12]. Еще более мало- числены сведения о протеолитической системе мицелия.
Ранее нами было описано расщепление при рН 7,4 протеиназами культуральной жидкости и мицелия Pleurotus ostreatus не только казеина, но и гемоглобина, желатина и фибриногена. Причем интенсивность расщепления перечисленных белков протеина- зами мицелия образовывала следующий ряд:
желатин > казеин > фибриноген > гемоглобин;
тогда как при действии экстрацеллюлярных протеиназ эта последовательность выглядела следующим образом:
казеин > желатин « фибриноген > гемоглобин [13].
Были также получены предварительные данные о влиянии рН на расщепление желатина и казеина гомогенатами мицелия и культуральной жидкостью [14]. Однако все эти результаты носят фрагментарный характер и не составляют целостной картины особенностей внутриклеточного и экстрацеллюлярного протеиназного аппарата мицелиальной культуры P. ostreatus.
Цель настоящей статьи - раскрыть особенности влияния группоспецифических ингибиторов и рН на расщепление белков субстратов протеиназами глубинной культуры гриба вешенка обыкновенная.
Материалы и методы
В работе использовали бактоагар (Melford, USA), казеин по Гаммерстену (Россия), гемоглобин быка, диизопропилфторфосфат и пепстатин A (Sigma, USA), желатин (Fluka, Germany), 1,10- фенантролин и ЭДТА (Alfa Aesar, Germany), /-хлормеркурибензоат (Carl Roth, Germany), 8-гидроксихинолин (Chem-impex, Germany). Остальные реактивы были квалификации «хч» производства стран СНГ. Исследования выполнены на «диком» штамме Pleurotus ostreatus, выделенном кандидатом биологических наук доцентом кафедры биотехнологии Е.О. Юрченко в 2014г. из плодовых тел, растущих на культурном тополе (Populus sp.) в г. Минске.
Как описано нами ранее, глубинное культивирование вешенки проводили в стеклянных колбах емкостью 500 мл при температуре 27 °С в течение 14 сут на качалке модели WiseShakeSHO-2D и режиме перемешивания 70 об/мин. [15]. В качестве питательной среды использовали отвар картофеля с добавлением сахарозы [16]. По окончании инкубации отбирали по 1 мл культуральной жидкости, а биомассу гриба из каждого образца отмывали, максимально просушивали на фильтровальной бумаге, навески по 0,5 г помещали в пробирки типа эппендорфа.
Культуральную жидкость использовали без дополнительного разведения. Навеску мицелия вешенки гомогенизировали на холоду в течение 2 мин в бидистилированной воде, центрифугировали в течение 10 мин при 4 °С и 8000 об/мин. Осветленный гомогенат использовали для дальнейших исследований. Протеолитическую активность определяли по расщеплению белков-субстратов в тонком слое агарового геля как подробно описано ранее [17]. В качестве растворителя при приготовлении белок-агаровых пластин использовали 0,15 М раствор NaCl рН 7,4. Для исследования рН- зависимости к исследуемым образцам добавляли 0,2 M ацетатный буфер рН 2,8-6,0, 0,05 M трис-HCl буфер рН 7,2-8,0 и 0,1 M боратный буфер рН 8,2-11,0. Растворы ингибиторов вносили в конечной концентрации 10-3 М, диизопропилфторфосфат и 8-гидроксихинолин растворяли в этаноле. Количество белка определяли колориметрическим методом [18]. Все исследования проведены не менее чем четырехкратно. Полученные результаты обработаны статистически с использованием программ Statistica 6.0 по t-критерию Стьюдента.
Результаты исследований и их обсуждение
рН-зависимость. Судя по полученным результатам, протеиназы мицелия способны расщеплять все три белка-субстрата в широком диапазоне рН. Так, желатинолитическая активность проявлялась в диапазоне рН 2,8 - 11,0 (рисунок 1а). Причем наиболее интенсивное расщепление желатина наблюдалось, начиная с рН 4,4, и к величине рН 5,6 достигало максимума. При дальнейшем увеличении рН до 8,5 колебания желатинолиза не превышали ±25%. Затем наблюдались некоторый спад желатинолитической активности, достаточно резкое увеличение ее при рН 9,02, повторное снижение, а при рН 10,6 - возрастание желатинолитической активности практически до уровня таковой в диапазоне рН 5,0-8,5.
рН-зависимость расщепления казеина характеризовалась тремя четко обозначившимися зонами наибольшей интенсивности данного процесса: рН 2,8, 4,0-5,0 и 6,0-8,2. При этом казеинолитическая активность также проявлялась вплоть до рН 9,0, хотя и в значительно меньшей степени, чем в упомянутых трех зонах (рисунок 1 а). Протеиназы мицелия вешенки очень слабо расщепляли гемоглобин при рН 2,8-4,2.
Однако уже при рН 4,6-5,6 гемоглобинолитическая активность резко возрастала с последующим снижением при рН 5,8. При дальнейшем увеличении рН, начиная с 7,0, вновь возрастала, достигая максимума при рН 8,4 - 134,5 ± 8,2 мм2, причем в диапазоне рН 8,09,5 колебания гемоглобинолитической активности составили ± 50%. Снижение ее до 62,8 ± 4,0 мм2 выявлено при рН 10,0, но при дальнейшем увеличении рН гемоглобинолитическая активность возрастала и при рН 11,0 ее уровень составлял 105,5 ± 16,5 мм2, не достигая, однако, максимальных значений в слабощелочной среде.
Рисунок 1. - рН-зависимость расщепления желатина (1), казеина (2) и гемоглобина (3) гомогенатами мицелия (а) или культуральной жидкостью (б) культуры вешенки обыкновенной
Иная картина наблюдалась при исследовании культуральной жидкости. Желатинолитическая активность ее также проявилась в широком диапазоне рН 3-11. Максимального уровня она достигала при рН 5,8, а в диапазоне рН 6,5-10,5 ее колебания соответствовали ± 25% (рисунок 1б). Расщепление же казеина экстрацеллюлярными протеиназами было выявлено лишь в щелочной среде, в узком диапазоне рН, начиная с 7,6, и достигало максимальной величины при рН 8,2. В более щелочной среде протеиназы культуральной жидкости этот белок не расщепляли. Близкая картина наблюдалась и для лизиса гемоглобина. В диапазоне рН 2,8-7,4 лизис гемоглобина вообще не определялся. И только начиная с рН 7,5, гемоглобинолитическая активность проявлялась в диапазоне рН 7,6-10,0, достигая максимума при рН 8,6-9,4. В более щелочной среде такая активность культуральной жидкости не зафиксирована (рисунок 1 б). Нужно также отметить, что содержание общего белка в гомогенате мицелия и в культуральной жидкости составляло 1,02 ± 0,01 и 0,18 ± 0,01 мг/мл соответственно.
Следовательно, мицелий данного гриба имеет достаточно разнообразный набор протеиназ, отличающихся широкой субстратной специфичностью. Можно полагать, что эти энзимы способны расщеплять и ряд других белков, которые не были использованы в рамках настоящей работы. Уже анализ рН-зависимости расщепления желатина, казеина и гемоглобина позволяет думать, что в протеолитическом арсенале мицелия присутствуют протеиназы нескольких типов. Это вполне объяснимо, ибо протеолитический ансамбль внутриклеточного плана выполняет очень многоплановые функции, включая целый ряд регуляторных. Экстрацеллюларные же протеиназы нацелены, прежде всего, на расщепление субстратов питательной среды. Однако, учитывая разницу концентрации белка в гомогенате мицелия и культуральной жидкости, активность экстрацеллюлярных протеиназ превосходит таковую мицелия гриба в ряде случаев на целый порядок. Можно полагать, что такая культуральная жидкость может быть использована, в известной степени, в качестве источника некоторых протеиназ. В целях предварительной идентификации арсенала протеиназ был проведен ингибиторный анализ при использовании в качестве субстратов желатина и казеина при величине рН среды, в которой выявлена наиболее высокая желатинолитическая и казеинолитическая активность (таблицы 1 и 2).