Материал: Казаков Е.Д., Карпиленко Г.П. - Биохимия зерна и хлебопродуктов

ГЛАВА б________________________________________________________________

Рис. 18. Схема образования промежуточного соединения фермент—субстрат

образование промежуточного соединения катализатора с суб- стратом (рис. 18) и последующий распад этого соединения, причем катализатор регенерируется.

Промежуточные реакции требуют значительно меньше энергии активации, чем реакция, идущая без участия катали- затора, поэтому они протекают со значительной быстротой, а, следовательно, и скорость суммарной реакции АВ -> А + В также значительно повышается. Так, гидролиз сахарозы с об- разованием из нее глюкозы и фруктозы без участия катализа- тора требует энергии активации, равной 134 кДж/моль. Если реакция катализируется ионами водорода, то энергия актива- ции снижается до 107 кДж/моль, а при катализе ферментом б-фруктофуранозидазой она составляет всего 39 кДж/моль. Ре- акция разложения пероксида водорода, происходящая без уча- стия катализатора, требует энергии активации, равной 75 кДж/ моль. Если реакция катализируется коллоидной платиной, то энергия активации понижается до 48 кДж/моль, а в присут- ствии фермента каталазы — до 5,4 кДж/моль. Фермент значи- тельно сильнее понижает энергию активации, чем неоргани- ческий катализатор. Катализатор приводит к некоторой деформации молекул субстрата при образовании промежу- точного комплекса катализатор — субстрат, что ослабляет внутримолекулярные связи, молекулы становятся более спо- собными к реакции.

________________________________________________ ФЕРМЕНТЫ

§ 4. СПЕЦИФИЧНОСТЬ И УСЛОВИЯ ДЕЙСТВИЯ ФЕРМЕНТОВ

Действие ферментов, в отличие от неорганических катали- заторов, строго специфично и зависит от строения субстрата, на который фермент действует. Примером такой зависимости

служит катализируемая аргиназой реакция гидролитического расщепления аминокислоты аргинина на орнитин и мочевину.

Дипептид, состоящий из остатков двух молекул аргинина,

Однако аргиназа не расщепляет метиловый эфир арги-

нина.

под действием аргиназы дает лишь половину количества мо-

чевины. Хотя расщепление аргинина происходит в месте, весь- ма отдаленном от карбоксильной (СООН) группы, необходи-

мым условием действия аргиназы является ее соединение с карбоксильной группой аргинина. Поэтому замещение водо-

рода в карбоксильной группе на метальный остаток или же связывание карбоксильной группы со второй молекулой арги- нина оказывает резкое влияние на действие аргиназы. Пример строгой специфичности действия— ферменты, катализиру- ющие химические превращения различных природных стерео- изомеров. Фермент, окисляющий природные L-аминокисло- ты, не действует на D-изомеры этих же аминокислот.

Фермент дипептидаза, гидролизирующий дипептиды, со- стоящие из остатков L-аминокислот, не действует на такие же дипептиды, состоящие из остатков D-аминокислот. Специ-

173

ГЛАВА 6

фичность действия ферментов послужила немецкому учено- му Эмилю Фишеру основанием для сравнения субстрата и фер- мента, катализирующего его превращение, с замком и соот- ветствующим ему ключом. Стереохимическая специфичность

ферментов теснейшим образом связана с одной из основных особенностей живых организмов — их способностью к синте- зу оптически активных органических соединений.

В образовании соединения между ферментом и субстратом так называемого фермент-субстратного комплекса принима- ют участие лишь некоторые функциональные группы молеку- лы фермента, образующие его активный центр. Функцио-

нальные группы могут находиться в разных местах молекулы субстрата, их сближение происходит благодаря свойственной молекуле фермента специфической пространственной (тре- тичной) структуре. Нарушение пространственной структуры молекулы фермента (ее активного центра) в результате де- натурации белка или каких-либо химических модификаций приводит к изменению или полной потере каталитической ак- тивности. В двухкомпонентных ферментах в образовании фер- мент-субстратного комплекса принимают участие не только функциональные группы апофермента, но и простетическая группа. Исключительно высокая специфичность действия ферментов объясняется их белковой природой. Пиридокса- левые ферменты, содержащие один и тот же кофермент (пи-

___________________________________________________________ФЕРМЕНТЫ

рость ферментативной реакции снижается, а при температурах, близких к 0 °С, реакция полнос- тью прекращается. При повыше- нии температуры выше оптималь- ной, скорость ферментативной реакции также снижается и, нако- нец, полностью прекращается. Снижение интенсивности дей- ствия ферментов (рис. 19, 20) при

повышении температуры сверх оптимальной объясняется глав- ным образом, начинающимся раз- рушением (денатурацией) входя-

щего в состав фермента белка. Поскольку белки в сухом состоянии денатурируются значительно медленнее, чем белки оводненные (в виде белкового геля или раствора), инактивиро- вание ферментов в сухом состоянии происходит гораздо мед- леннее, чем в присутствии влаги.

Наблюдаемая в практике работы с зерном большая устойчи-

вость сухого зерна к повышенной температуре с сохранением биологических и технологических свойств по сравнению с тем же, но увлажненным зерном объясняется этими особенностя- ми тепловой денатурации белков и инактивации ферментов.

Важным фактором, от которо- го зависит действие ферментов,

является активная реакция среды

- рН (рис. 21, 22, 23, 24). Отдельные

ферменты различаются по оптимальной для их действия величине рН. Оптимум действия б-фруктофуранозидазы находится в широкой зоне рН — от 4,0 до 5,5.

ГЛАВА 6

Рис. 22. Влияние кислотности на активность протеаз муки: 1 — пшеницы; 2 — ржи; 3 — тритикале

бильна, чем а-амилаза, которая выдерживает более высокую температуру. Большое влияние на скорость ферментативной реакции оказывает концентрация субстрата (рис. 24).

Действие ферментов зависит также от присутствия спе- цифических активаторов и неспецифических или специфи- ческих ингибиторов. Многие ферменты активизируются в

ФЕРМЕНТЫ

ря тому, что может существовать

вдвух формах — восстановлен- ной (Г—SH) и окисленной.

Цистеин и глютатион играют большую роль в биохимических процессах, происходящих в тесте. Ингибирование (угне- тение) ферментов происходит под действием различных ве- ществ, образующих с белками нерастворимые осадки или бло- кирующих в них какие-либо

группы (например, —SH—группу). Существуют специфические ингибиторы ферментов, угнетение которыми каталитических функций основано на специфическом связывании этих инги- биторов с определенными химическими группировками в ак-

тивном центре фермента. Диоксид углерода (СО2) специфи- чески ингибирует ряд окислительных ферментов, содержащих

вактивном центре железо или медь. Вступая в химическое со-

окисленная форма глютатиона

177

ГЛАВА 6

единение с этими металлами, оксид углерода блокирует ак- тивный центр фермента, который вследствие этого теряет свою активность. Различают обратимое и необратимое ингибиро- вание ферментов. В случае обратимого ингибирования (напри- мер, действие малоновой кислоты на сукцинатдегидрогеназу) активность фермента восстанавливается при удалении инги- битора диализом или иным способом.

При необратимом ингибировании действие ингибитора даже при его низких концентрациях со временем усиливается и наступает полное торможение активности фермента. Инги- бирование может быть конкурентным и неконкурентным. При конкурентном ингибировании ингибитор и субстрат конку- рируют между собой, стремясь вытеснить друг друга из фер- мент-субстратного комплекса. Действие конкурентного ин- гибитора снимается высокими концентрациями субстрата, в

то время как действие неконкурентного ингибитора в этих условиях сохраняется. Действие на ферменты специфических активаторов и ингибиторов имеет большое значение для ре- гулирования ферментативных процессов в организме.

§ 5. СВОЙСТВАИ ИЗМЕНЕНИЕ АКТИВНОСТИ ФЕРМЕНТОВ

Ферменты имеют ряд общих свойств с химическими, небиологическими катализаторами. Ферменты, как и небио- логические катализаторы, не расходуются в процессе катали- за, не входят в состав конечных продуктов реакции и выходят из реакции в первоначальном виде. Ферменты только ускоря- ют реакции, протекающие и без них. Они не могут возбудить реакции, противоречащие законам термодинамики. Фермен- ты, как и неорганические катализаторы, не смещают положе- ния равновесия реакции, а лишь ускоряют его достижение.

Ферменты имеют отличительные свойства, характерные только для них. Все ферменты — белки. Скорости реакций, катализируемые ферментами, во много раз выше, чем реакции, протекающие с участием химических катализаторов. Для фер-

ментов характерна узкая избирательность действия на строго определенные превращаемые вещества (субстраты).

178

ФЕРМЕНТЫ

Важнейшее свойство ферментов — их регулируемость. Ре-

гуляция ферментативных систем лежит в основе координации всех процессов метаболизма во времени и пространстве, что обеспечивает воспроизведение живой материи, стабилизацию внутриклеточной среды, приспособление к изменяющимся внешним условиям. Для ферментативных реакций характерен почти 100%-ный выход продуктов. Побочные процессы не- значительны по сравнению с неферментативным катализом.

Наличие фермента распознается по проявлениям катали- зируемой им химической реакции. Скорость реакции (актив- ность фермента) измеряют обычно в произвольных единицах.

Рекомендуется соблюдать при этом определенные условия (концентрация субстрата, температура, рН). Например, актив- ность б-амилазы оценивают по количеству образовавшейся из крахмала мальтозы (мг) на 10 г зерна (муки) в условиях опыта. Активность каталазы выражают в миллилитрах 0,1 н КМпО4, затраченных на титрование (в условиях опыта) оставшегося не- использованным пероксида водорода, или в количестве разложенной Н2О2. Международный биохимический союз ре-

комендует скорость реакции измерять в молях исходного или конечного продукта реакции в секунду. Для выражения ката-

литической активности фермента рекомендуется применять показатель, называемый каталом. Под каталом понимают ка- талитическую активность, способную осуществлять реакцию со скоростью, равной 1 моль в 1 с. Можно применять также дробные величины катала: микрокаталы (10~6)— 1 мккат, на- нокаталы (10~9) — нкат, пикокаталы (10~12) — пкат, чему отве- чают скорости реакций, выражающиеся в микромолях, нано- молях и пикомолях в 1 с.

§ 6. КЛАССИФИКАЦИЯИ НОМЕНКЛАТУРАФЕРМЕНТОВ

По рекомендациям Международного биохимического со- юза ферменты разделяют на шесть классов: оксидоредуктазы, грансферазы, гидролазы, лиазы, изомеразы, лигазы.

Код (индекс) каждого фермента содержит четыре числа, разделенных точками. Первая цифра указывает класс, вто-

ГЛАВА 6

рая — подкласс, третья — подподкласс, четвертая — поряд- ковый номер в данном подподклассе. Так, фермент а-амила- за, расщепляющий крахмал с образованием главным образом декстринов и небольшого количества мальтозы, имеет код 3.2.1.1, т. е. относится к классу гидролаз, подклассу фермен-

тов, действующих на гликозильные соединения, подподклас-су ферментов, гидролизующих о-гликозильные соединения.

Класс оксидоредуктаз. Включает ферменты, катализирующие окислительно-восстановительные реакции. Класс насчитывает 17 подклассов в зависимости от природы той группы в молекуле субстрата, которая подвергается окислению (спир- товая, альдегидная, кетонная и т. д.). Третье число показывает тип используемого акцептора: кофермента, цитохрома, моле- кулярного кислорода и т. д.

Класс трансфераз. Объединяет ферменты, катализирующие реакции переноса групп (метильных, гликозильных, аминных и др.) от одного соединения (донора) к другому соединению (акцептору), подразделяется на 8 подклассов в зависимости от природы переносимых групп. Третья цифра характеризует тип переносимых групп (например, одноуглеродная группа может быть метилом, карбоксилом, формилом и т.д.).

Класс гидролаз. Включает ферменты, катализирующие гидролитическое расщепление различных соединений; он раз- деляется на 11 подклассов в зависимости от типа гидролизуе- мой связи — сложноэфирной, пептидной, гликозидной и т. д. Третья цифра обычно уточняет природу субстрата (например, в подклассе эстераз различают эстеразы сложных эфиров кар- боновых кислот, гидролазы тиоэфиров, фосфомоноэстеразы).

Класс лиаз. Действие ферментов основано на отщеплении от субстрата той или иной группы (негидролитическим путем) с

образованием двойной связи или присоединении группы к двойным связям. У лиаз 6 подклассов. Вторая цифра кода обо- значает тип подвергающейся разрыву связи (углерод—углерод, углерод—кислород и т. д.), а третья — тип отщепляемой группы

(СО2, Н2О и др.).

Класс изомераз. Объединяет ферменты, катализирующие реакции изомеризации, т. е. структурные изменения в преде- лах одной молекулы. Класс изомераз разделяется на 5 подклас-

180

___________________________________________________ФЕРМЕНТЫ

сов в зависимости от типа катализируемой реакции, а подпод- классы — по типам субстрата.

Класс лигаз (или синтетаз). Ферменты, которые катализи- руют соединение двух молекул друг с другом, сопряженное с гидролизом высокоэнергетической связи в молекуле аденозин- трифосфорной кислоты (АТР) или аналогичного трифосфа- та. Лигазы разделяются на 5 подклассов по типу образуемой связи (углерод — азот, углерод — кислород и т. д.). Подклассы фигурируют только в подклассе С—N— лигаз.

§7. ФЕРМЕНТЫ ЗЕРНА

Взерне злаковых растений, как и во всяком живом орга- низме, большое количество ферментов. Рассмотрим некото- рые из них, имеющие наибольшее значение для биохимиче- ских процессов, протекающих в зерне и оказывающих

влияние на качественное состояние зерна при хранении и его переработке.

Ферменты первого класса. Это оксидазы: монофенол-моно- оксигеназа (тирозиназа), аскорбатоксидаза, пероксидаза, ка- талаза и липоксигеназа.

Монофенол-монооксигеназа (1.14.18.1) окисляет амино- кислоту тирозин с образованием темноокрашенных соедине- ний — меланинов. Активная монофенол-монооксигеназа со- держится в ржаной муке и грибах. Темный цвет ржаного хлеба частично объясняется действием монофенол-монооксигена- (ы. Той же причиной объясняется наблюдающееся потемне- ние некоторых партий макарон при их сушке, некоторые сор- та пшеницы содержат активную монофенол-монооксигеназу.

Аскорбатоксидаза (1.10.3.3) представляет собой белок, содержащий медь (0,24%).

Врастениях имеется оксидаза, которая превращает аскор- биновую кислоту в дегидроаскорбиновую.

Пероксидаза (1.11.1.7) способствует окислению органиче- ских соединений пероксидом водорода в живом организме. Может окислять те или иные соединения с помощью перок- сида водорода или каких-либо органических примесей. С пе- роксидом водорода она образует комплексное соединение, в