Курсовая работа (т): Изучение потребностей прокариот в питательных веществах

Изучение потребностей прокариот в питательных веществах

Введение

Микробиология в своем развитии зачастую опирается на химическую и биохимическую основы. Перед культивированием и изучением микроорганизмов необходимо установить тип и особенности питания данного вида, его потребности в источниках биогенных элементов. Каждый вид микроорганизмов имеет свои потребности в питательных веществах, следовательно, и особый состав питательных сред для культивирования, свою экологическую нишу в природе.

Прокариоты - это надцарство организмов, которые имеют свои особенности. Клетки прокариот не имеют оформленного ядра и других внутренних мембранных органелл. К прокариотам относят архебактерии и эубактерии. Они различны по месту обитания, и особенностям метаболизма.

Целью данной работы является изучение потребностей прокариот в питательных веществах. Основные задачи заключаются в рассмотрении разнообразия источников питания прокариот, анализе связи между питанием и метаболизмом, определение факторов наибольшей продуктивности и роста, изучение универсальных и специальных сред.

Объектом изучения являются различные неорганические и органические вещества, которые могут служить источником питания для прокариот. Так, в данной работе будут рассмотрены источники основных биогенных химических элементов, которые нужны для построения и функционирования прокариотической клетки.

Знания о потребностях в питательных веществах прокариот используется на биотехнологических производствах, в научных лабораториях. С помощью таких знаний можно найти самые дешевые источники питания, и таким образом, удешевить микробиологическое производство, а также достичь максимальной продуктивности.

1. Источники углерода

Все соединения, из которых построены живые организмы - это соединения углерода. Углероду принадлежит основная роль в конструктивном метаболизме. Прокариоты способны воздействовать на любое углеродное соединение, т.е. использовать его в своем в своем метаболизме. В зависимости от источника углерода все прокариоты делятся на две группы: автотрофы, к которым принадлежат организмы, способные синтезировать все компоненты клетки из углекислоты или других неорганических соединений, и гетеротрофы, источником углерода для конструктивного метаболизма которых служат органические соединения. Следует отметить, что в мире прокариот не существует резкой границы между авто- и гетеротрофными организмами [1, 2, 3].

1.1    Неорганические соединения углерода

К самым распространенным неорганическим соединениям углерода относят СО₂ и СО, а также углекислоту и соли углекислоты - карбонаты [4].

Углекислый газ в качестве субстрата используют хемолитотрофы и фототрофы.

Хемолитотрофы в качестве единственного источника углерода используют СО₂ и превращают его в клеточный материал, используя энергию ATP и восстановительные эквиваленты, полученные при окислении неорганических субстратов. Такие микроорганизмы часто называют С-автотрофами. Фиксация СО₂ у хемолитотрофов осуществляется в результате цикла Кальвина. К таким бактериям относят цианобактерии.

Так же двуокись углерода в качестве источника углерода используют фототрофные бактерии трех семейств: Rhodospirillaceae (пурпурные несерные бактерии), Chromatiaceae (пурпурные серобактерии) и Chlorobiacaeae (зеленые бактерии).

Цианобактерии восстанавливают СО₂ водой, а пурпурные и зеленые бактерии - сероводородом и газообразным водородом; или пурпурные - органическими соединениями. При этом в процессе фотосинтеза цианобактерии выделяют кислород, а пурпурные и зеленые бактерии его не выделяют и фотосинтез у них происходит в анаэробных условиях.

Метанобразующие бактерии способны анаэробно сбраживать СО₂ с водородом по реакции:

СО₂+4Н₂→СН₄+2Н₂О

К хорошо изученным бактериям, имеющим такую способность относят Methanobacterium ruminantium, Methanobacterium thermoautotrophicum и Methanobacterium MoH [5, 6].

Угарный газ для большинства микроорганизмов является ядом, поскольку инактивирует цитохромоксидазы. Но есть виды, которые растут в аэробных условиях в присутствии СО: Hydrogenomonas carboxydovorans и Seliberia carboxyhydrogena (обе бактерии сейчас относят к роду Pseudomonas). СО окисляется до СО₂ , а перенос освобождающихся электронов на кислород сопровождается синтезом ATP. При окислении угарного газа используется особая, не чувствительная к CO цитохромоксидаза. Данные бактерии называют карбокситрофными [5, 7].

1.2    Органические соединения углерода

1.2.1 Углеводороды и их производные

Метанотрофы в качестве источника углерода используют метан. Окисление метана осуществляется в последовательности реакций:

СН₄→ СН₃ОН→ НСНО→ НСООН→ СО₂

Ассимиляция углерода С₁-соединений метанотрофами происходит в основном на уровне формальдегида и углекислого газа. У данных бактерий существуют два циклических пути ассимиляции углерода метана: рибулозомонофосфатный и сериновый пути. Так же, метанотрофы способны использовать в качестве дополнительного источника углерода СО₂ , причем у бактерий, которые используют сериновый путь, эта способность выражена сильнее. Кроме метана и диоксида углерода, метанотрофы способны к утилизации метанола.

Факультативные метанотрофы кроме метана и его производных могут использовать полиуглеродные соединения в качестве источника углерода и энергии. Однако их способность к росту за счет метана однозначно не доказана.

Метилотрофные бактерии используют метанол, а также его производные (не имеющие С-С связей) в качестве основного источника углерода. К таким бактериям относят Methylobacterium organophilum, представители Hiphomicrobium [5, 8].

Метанобразующие бактерии используют в качестве субстрата (кроме СО₂) формиат, метанол, и ацетат. Формиат сначала превращается в СО₂ и водород, а потом только в метан. Метанол - хороший субстрат для Methanosarcina barkeri, является прямым предшественником метана. Ацетат относится к наиболее важным субстратам для образования метана в озерных осадках. Он превращается Methanosarcina barkeri, Methanospirillum hungatii и некоторыми другими метанобразующими бактериями в метан и СО₂.

На этане, пропане, бутане и углеводородах, содержащих до восьми атомов углерода способны расти относительно немного видов бактерий (микобактерии, флавобактерии, Nocardia). Использование же углеводородов с длинной цепью распространено у микроорганизмов широко, и н-алканы с 10-18 атомами углерода используются очень часто и с огромной скоростью. Среди бактерий это Pseudomonas fluorescens, Mycobacterium smegmatis, Nocardia petroleophila и др.

Этанол в качестве субстрата используют уксуснокислые бактерии. При этом одни виды (напр.Gluconobacter suboxydans) выделяют ацетат во внешнюю среду, так как не способны его утилизировать, а другие используют ацетат и окисляют его до СО₂, в условиях недостатка этанола. Кроме этанола, уксуснокислые бактерии окисляют большое число других спиртов (пропанол, изопропанол, глицерол) до соответствующих кислот и кетонов [5].

Стоит отметить, что питательная ценность источников углерода зависит от степени окисления атома С в соединении. Для большинства микроорганизмов лучшие источники углерода - органические соединения, содержащие частично окисленные атомы углерода. Значительно хуже ассимилируются вещества с большим количеством полностью восстановленных углеродов. Почти совсем не усваиваются органические соединения, содержащие углерод только в форме карбоксила -СООН.

Бактерии, которые используют данные источники углерода, являются специализированными. Они растут на определенном источнике, и имеют специализированные метаболические пути для их усвоения [9, 10].

1.2.2 Ароматические соединения

Ряд бактерий способны расщеплять гентизиновую кислоту (рис.1), образуя в результате фумарат и пируват.

Рис 1.2.2.1 - Гентизиновая кислота [5]

Существует целый ряд ароматических соединений, которые под действием бактерий превращаются в катехол и протокатеховую кислоту. На рис.2 и 3 показаны катаболические пути, ведущие к образованию катехола и протокатехоловой кислоты.

Рис 1.2.2.2 - Соединения, которые могут быть превращены в катехол [5]

Рис 1.2.2.3 - Ароматические и гидроароматические соединения, которые могут быть превращены в протокатеховую кислоту [5]

Катехол и протокатеховая кислота могут метаболизироватся в ходе орто-расщепления и мета-расщепления. Конечным продуктом является сукцинат. Разрыв ароматического кольца осуществляют диоксигеназы. При этом в субстрат включается молекулярный кислород.

Некоторые бактерии способны расщеплять полициклические углеводороды: нафталин, антрацен и фенантрен. Если выращивать бактерии на среде, содержащей одно из этих соединений, то можно часто наблюдать выделения в культуральную жидкость салициловой кислоты.

При благоприятных условиях даже асфальт подвергается разложению, хотя и очень медленно. В почве, населенной микроорганизмами, окисляется даже графит [5, 11].

.2.3   Углеводы

Большинству бактерий в качестве источника углерода нужны углеводы. Такие виды бактерий являются самыми распространенными. Углеводы усваиваются в виде D-изомеров, что является очень важным, так как мало бактерий имеют ферменты (рацемазы), способные превращать один оптический изомер в другой [7, 10].

Углеводы в качестве основного субстрата используют практически все гетеротрофные бактерии. Наиболее универсальным субстратом для культивирования бактерий является глюкоза. Способность усваивать разные углеводы является диагностическим признаком. Существуют специальные среды с индикаторами для определения потребления того или иного углевода видом бактерий [10, 12].

Углеводы выступают не только источником углерода для клетки, но и источниками энергии. Бактерии окисляют углеводы до органических кислот, или СО₂ для получения энергии; также используют углеводы как строительный материал. Например, Escherichia coli использует глюкозу и для получения энергии, и для построения клеточных фрагментов (рис.1) [13].

Рисунок 1.2.3.1 - Схема использования глюкозы клеткой E.coli [5]

Транспорт глюкозы в клетку происходит с помощью фосфоенолпируватглюкоза-фосфотрансферазной системы. Далее глюкоза-6-фосфат расщепляется по пути Эмбдена-Мейергофа-Парнаса до пирувата. Этот путь впервые был открыт в мышечных тканях, еще его называют гликолизом. Гликолиз является универсальным путем катаболизма глюкозы [5, 14].

У аэробных бактерий гликолиз составляет первую стадию полного аэробного расщепления глюкозы до СО₂ и воды. Образовавшийся при гликолизе пируват потом теряет СО₂, а оставшийся двухуглеродный фрагмент включается в ацетил-КоА, и далее полностью окисляется до СО₂ и Н₂О в цикле лимонной кислоты. За таким механизмом усваивают глюкозу строго аэробные бактерии, могут и факультативно анаэробные [5, 15].

Анаэробные бактерии, которые после этапа гликолиза восстанавливают пируват до лактата - молочнокислые бактерии. Молочная кислота, образующаяся в результате их деятельности, вызывает скисание молока. Молочнокислое брожение протикает по двум путям: гомоферментативному и гетероферментативному. По особой схеме расщепляют глюкозу бифидобактерии.

Бактерии рода Zymomonas способны превращать глюкозу в этиловый спирт. Но превращении глюкозы в пируват у них идет по пути Энтнера-Дудорова. Sarcina ventriculi (строгий анаэроб) и Erwinia amylovora(факультативная анаэробная энтеробактерия) сбраживают глюкозу до этанола и СО₂ по гликолитическому пути, а также образуют побочные продукты в малых количествах: ацетат, молекулярный водород и лактат.[5, 14]

Некоторые облигатные анаэробы в качестве основного продукта брожения образуют бутират; к ним относятся представители четырех родов: Clostridium, Butyrivibrio, Eubacterium, Fusobacterium. Когда процесс брожения проходит на половину и рН среды снизился до 4,5, образуются новые продукты: ацетон и бутанол.

Также в ходе пропионовокислого и янтарнокислого брожения из глюкозы образуются пропионат, ацетат и СО₂. Предпочтительным субстратом для пропионовокислых бактерий является лактат.[5, 16]

Фруктоза также служит хорошим субстратом для многих бактерий. Как и в случае глюкозы, поступление фруктозы в клетки обеспечивается фосфоенолпируват-фосфотрансферазной системой. Однако в этом случае в клетке образуется фруктозо-1-фосфат, а не фруктозо-6-фосфат. Синтез фермента 1-фосфофруктокиназы специфически индуцируется фруктозой. При брожении фруктозы образуются лактат, ацетат, СО₂. Leuconostoc mesenteroides сбраживает фруктозу с образованием маннитола [5].

Гетероферментативные лактобациллы L.brevis и L.buchnery не могут расти в анаэробных условиях в присутствии глюкозы, зато могут в присутствии фруктозы [15].

Для использования лактозы, клеткам E.coli требуются дополнительные ферменты, образование которых индуцируется только при наличии в среде лактозы. Причем индукция происходит тогда, когда в питательной среде исчерпана глюкоза. Лактозопермеаза транспортирует лактозу в клетку, а в-галактозиада гидролизирует ее до галактозы и глюкозы [5, 17].

Сахарозу могут использовать многие бактерии. Например, молочнокислые бактерии растут на питательных средах с сахарозой, и синтезируют из нее внеклеточные полисахариды: декстран и леван [15].

Мальтозу могут использовать те организмы, которые используют и глюкозу. Но они должны иметь фермент мальтазу для расщепления мальтозы вне клетки, или соответствующие пермеазы для фосфоролитического расщепления в клетке [11, 18].

Пентозы бактерии способны утилизировать пентозофасфатном пути. По этому пути возможно превращение пентозофосфатов в гексозофосфаты и наоборот. Пентозофосфаты являются предшественниками нуклеотидов и нуклеиновых кислот в клетке. Среди пентоз наиболее широко потребляемым сахаром является ксилоза [10, 11, 19].

Рафинозу способны использовать в качестве субстрата бактерии кишечника человека (включая E.coli), в процессе расщепления в довольно больших количествах образуются газы: водород, диоксид углерода и метан [20].

Бактерии способны потреблять целлюлозу. Для расщепления таких больших молекул, бактерии сначала выделяют экзоферменты, и гидролизируют субстрат вне клетки. В почве целлюлозу разлагают аэробные и анаэробные бактерии. У таких видов бактерий в наборе ферментов преобладают целлюлитические ферменты, гидролизирующие целлюлозу до глюкозы. Аэробные бактерии выделяют много слизи, живут преимущественно в почве. В анаэробных условиях целлюлозу расщепляют чаще всего мезофильные и термофильные клостридии. Бактерии, которые живут в рубце жвачных животных, перерабатывают полимерные углеводы кормов в жирные кислоты и спирты. Продуктами анаэробного расщепления в почве являются этанол, уксусная, муравьиная и молочные кислоты, Н₂ и СО₂.

Крахмал бактерии могут расщеплять тремя способами: 1) фосфоролиз, 2) гидролиз и 3) трансгликозилирование. Фосфоролиз катализирует фермент б-1,4-глюканфосфорилаза, которая отщепляет по одной молекуле глюкозо-1-фосфата. Фосфорилазы играют решающую роль при мобилизации накопленных в клетках полисахаридов. Гидролиз катализируют амилазы вне клетки. У многих микроорганизмов имеется б-амилаза (эндоамилаза) и амило-1,6-глюкозидаза. Продуктами расщепления, кроме мальтозы, также олигомеры, содержащие от 3 до 7 остатков глюкозы.