изолированного помещения – бокса, в котором проводят пересевы чистых культур микроорганизмов в условиях строгой стерильности.
Помещения должны располагаться так, чтобы были обеспечены их защита от влияния внешних факторов (повышенной температуры, влажности, запыленности, шума, вибрации); прохождение чистых и зараженных материалов без пересечения путей. В каждом помещении должны быть холодное и горячее водоснабжение, емкость с раствором для дезинфекции рук.
3.1. Аппаратура и оборудование
Микробиологическая лаборатория должна быть оборудована:
–автоклавами (не менее двух);
–электрическими суховоздушными или водяными термостатами, отрегулированными на разные температурные режимы;
–холодильниками (несколько штук);
–дистилляторами;
–центрифугами;
–рН-метром;
–весами лабораторными, техническими, аналитическими разных классов точности;
–водяной баней с автоматическим терморегулятором для сохранения расплавленных агаровых сред до употребления или культивирования посевов при постоянной температуре;
–стерилизационным сушильным шкафом с автоматическим терморегулятором для стерилизации стеклянной посуды;
–электроплитками, спиртовками;
–рефрактометром;
–микроскопами различных систем.
Для проведения исследований и облегчения выполнения трудоемких операций допускается использование различных приборов и оборудования: дозатора питательных сред и реактивов, механического смесителя, устройств для фильтрования, прибора для подсчета колоний, аппарата для культивирования в модифицированной среде (анаэростат).
Из лабораторной посуды необходимо иметь: стеклянные или пластиковые емкости (пробирки, колбы, флаконы, бутыли); стеклянные
21
или пластиковые чашки Петри (как правило, диаметром 90–100 мм); пипетки пастеровские и градуированные вместимостью 10, 5, 2, 1 см3; воронки, цилиндры, мензурки, капельницы и другую посуду. В лаборатории должно быть достаточное количество предметных и покровных стекол, лабораторных инструментов: ножниц, пинцетов, скальпелей, кювет, игл и петель для посевов и пересевов культур.
На рабочем столе (с покрытием, необходимым для удобства проведения санитарной обработки) находятся: микроскоп, штатив с красителями для приготовления окрашенных мазков, пробирки со стерильной водой, спиртовка для создания асептических условий, микробиологическая петля, фарфоровые стаканы для использованных пипеток и предметных стекол, штатив для пробирок с культурами микроорганизмов.
В рабочем столе находятся: обезжиренные предметные и покровные стекла, небольшие кусочки фильтровальной бумаги для просушивания препаратов, спички для зажигания спиртовки, карандаш по стеклу.
3.2. Бокс
Бокс представляет собой небольшую комнату, разделенную на две части. Основное помещение предназначено для проведения микробиологических работ, вторая часть бокса (предбоксник) необходима для того, чтобы не допустить прямого контакта помещения для пересевов с наружным помещением. Такое устройство исключает резкое перемещение воздуха и, следовательно, занесение извне посторонней микрофлоры. В предбокснике должен находиться комплект чистой рабочей одежды: халат, колпачок или косынка и тапочки, в которых можно находиться только в помещении бокса.
Все поверхности в боксе должны иметь покрытия, допускающие обработку дезинфицирующими составами, стойкие к ультрафиолетовому излучению, применяемому для стерилизации бокса.
На рабочем столе необходимо иметь спиртовку, спички, штатив для пробирок, биологическую петлю и иглу, восковой карандаш по стеклу или маркер, спирт, вату, стакан для использованных в работе пипеток и шпателей. Перед началом работы руки и поверхность стола обязательно протирают 70 %-м раствором этилового спирта.
22
Помещение бокса стерилизуют с помощью бактерицидных ламп, прикрепленных к стенкам бокса на уровне 1,5–2,0 м от пола; одну лампу устанавливают на расстоянии 60–70 см над поверхностью стола.
3.3. Правила работы с микроорганизмами
При работе в микробиологической лаборатории необходимо соблюдение ряда правил.
Микроорганизмы в лабораторных условиях выращивают обычно в пробирках, колбах, чашках Петри в жидких и плотных питательных средах.
При пересеве дрожжей с одной среды на другую или при извлечении части клеток для приготовления препарата необходимо строго соблюдать условия, которые позволили бы предохранить культуру от загрязнения другими микроорганизмами.
Для приготовления препаратов микроорганизмов, выращенных на поверхности плотной питательной среды, или для пересевов культуры с одной среды на другую пользуются бактериологической петлей. Стерилизацию петли проводят в пламени горелки, прокаливая докрасна проволоку и обжигая примыкающую к ней часть держателя, вводимую внутрь пробирки. При прокаливании петлю рекомендуется держать в пламени почти вертикально, чтобы проволока была равномерно раскалена на всем протяжении. Лишь после такой стерилизации петлю можно вводить в пробирку с культурой микроорганизма. Прикосновение к культуре слишком горячей петли может повредить клетки. Поэтому петлю следует предварительно остудить, прикоснувшись ею к внутренней поверхности пробирки или к питательной среде, свободной от клеток.
Оставшиеся на петле после пересева или приготовления препарата клетки тщательно сжигают в пламени горелки. Прокаливание петли в этом случае начинают с участка проволоки, примыкающего к кольцу, чтобы микробная масса, оставшаяся на петле, подсохла. Затем петлю переводят в вертикальное положение и прокаливают докрасна. Такой порядок стерилизации петли необходим потому, что при быстром нагревании влажной микробной массы происходит ее разбрызги-
23
вание и образуется аэрозоль, загрязняющий воздух. Только после этого петлю можно поместить в специальный штатив.
Необходимо следить за тем, чтобы дрожжевые препараты не загрязняли руки, стол и окружающие предметы.
Ватные пробки, закрывающие сосуды с микроорганизмами, не должны своей внутренней частью соприкасаться со столом или руками.
Всю рабочую лабораторную посуду, содержащую живые микроорганизмы, после работы необходимо подвергнуть термической обработке в автоклаве.
При работе со спиртовками, особенно в условиях бокса, следует остерегаться воспламенения паров спирта, следить за своевременным заполнением спиртовки, не зажигать ее от другой спиртовки, гасить пламя только специальным колпачком.
В случае воспламенения ватных пробок в пробирках или колбах необходимо укрыть их полотенцем, перекрыв к ним доступ воздуха.
4. ИЗУЧЕНИЕ КУЛЬТУРАЛЬНЫХ И МОРФОЛОГИЧЕСКИХ ПРИЗНАКОВ ДРОЖЖЕЙ
Цель работы – получение практических навыков при посеве дрожжей в жидкую и плотную питательные среды, изучение макроморфологических признаков колоний и морфологических признаков клеток дрожжей различных родов и видов.
4.1. Приготовление питательных сред
Для изучения макроморфологических особенностей клеток дрожжи культивируют на поверхности солодового агара, морфологических – в жидком солодовом сусле. Солодовое сусло готовят с содержанием 8–10 % сухих веществ и стерилизуют при 112 °С в течение 20 мин. В охлажденное сусло вносят дрожжи с поверхности скошенного сусла-агара.
При приготовлении сусла-агара к солодовому суслу добавляют 2 % агара, нагревают при перемешивании до кипения, разливают в пробирки или колбы и стерилизуют при 112 °С в течение 20 мин.
Стерильную агаровую среду разливают в чашки Петри при соблюдении условий асептики. Чашки оставляют в боксе на двое–трое
24
суток для подсушивания среды. Затем каплю дрожжевой суспензии помещают на поверхность сусла-агара в чашке Петри, равномерно растирая ее стерильным стеклянным шпателем и, не обжигая шпатель в пламени спиртовки, растирают им поверхности второй и третьей чашек Петри. После рассева дрожжи инкубируют при 26–28 °С в течение трех–пяти суток. Как правило, на поверхности питательной среды последней чашки дрожжи растут в виде изолированных колоний.
При другом способе рассева (истощающим мазком) каплю дрожжевой суспензии с помощью микробиологической петли наносят на поверхность плотной питательной среды, содержащейся в чашке Петри, и растирают ее петлей на 1/4 поверхности. Затем, не обжигая петлю в пламени спиртовки, в той же чашке последовательно на остальных частях среды проводят ряд штрихов. На последних штрихах дрожжи вырастают в виде изолированных колоний.
Используемые среды и растворы. Для приготовления солодово-
го сусла в 1 дм3 водопроводной воды, нагретой до 48–50 °С, понемногу засыпают 250 г размолотого солода, помешивая, чтобы не образовывались комки. Температура при этом снижается до 45 °С. Ее следует поддерживать на этом уровне в течение 30 мин в водяной бане. По истечении этого времени взвесь нагревают до 55–58 °С и выдерживают при этой температуре в течение часа. Затем температуру повышают до 63 °С и поддерживают на этом уровне до полного осахаривания крахмала. Полноту осахаривания проверяют с помощью раствора Люголя – до появления желто-коричневой окраски сусла. Свежеприготовленное солодовое сусло нагревают до кипения и кипятят 5–10 мин. Образовавшийся при кипении осадок отделяют фильтрованием. В целях получения совершенно прозрачного сусла его дополнительно осветляют яичным белком. Для этого белки яиц, взбитые с двойным (по объему) количеством воды, вносят в сусло, нагретое до 50 °С, и тщательно перемешивают. При этом белок свертывается и увлекает в осадок оставшиеся в сусле взвешенные частицы. Осадок удаляют фильтрованием сусла через складчатый фильтр. Затем сусло разводят водой до содержания 8–10 % сухих веществ, разливают в колбы или пробирки и стерилизуют при 112 °С в течение 30 мин.
Раствор Люголя готовят следующим образом: 2 г йодистого калия растворяют в 5 см3 воды и прибавляют 1 г кристаллического йода, затем доводят объем до 300 см3.
25