Материал: Д6343 Черныш ВГ Изучение морфологии различных видов дрожжей

4.2. Морфологические особенности дрожжей

Для наблюдения дрожжей в световом микроскопе необходимо соответствующим образом приготовить препарат. Как правило, препараты готовят на предметных стеклах. Предметные стекла должны иметь толщину, не превышающую 1,2–1,4 мм. Применение более толстых стекол снижает четкость изображения. Поверхность предметных стекол должна быть хорошо подготовлена. Стекло надо тщательно очистить и обезжирить, чтобы жидкость равномерно растекалась по нему, а не собиралась в выпуклые, медленно высыхающие капли. Наиболее надежный способ обезжиривания – обработка стекол хромовой смесью с последующим ополаскиванием водой и спиртом. Можно также тщательно натереть сухое стекло мылом, после чего вытереть хлопчатобумажной салфеткой. Еще один способ – обжигание поверхности стекла в пламени горелки (жир при этом сгорает).

Покровные стекла также должны быть вымыты и высушены. Толщина покровных стекол не должна превышать 0,15–0,17 мм. Кипячение стекол в растворах щелочей не рекомендуется, так как щелочи разъедают стекло, его поверхность становится матовой.

1. Изучение роста дрожжей в жидкой питательной среде.

После инкубации дрожжей в течение семи суток отмечают наличие пленки или островков пленки на поверхности сусла, а также на стенках сосуда; наличие пристеночного кольца, характер осадка (плотный, рыхлый), мути. Характер роста дрожжей зарисовывают.

2. Исследование морфологии клеток различных дрожжей. Го-

товят препараты из каждой представленной культуры: Saccharomyces cerevisiae, Torulopsis aeria, C.krusei, Rhodotorula rubra, Hansenula anomala, S.diastaticus, Kluyveromyces fragilis. Для этого на поверхность обезжиренного предметного стекла микробиологической петлей наносят каплю суспензии исследуемой культуры из жидкой питательной среды. Затем осторожно покрывают покровным стеклом каплю так, чтобы между покровным и предметным стеклами не было пузырьков воздуха и жидкость не выступала за края покровного стекла. Дрожжи микроскопируют в препарате «раздавленная» капля. Изучают морфологические особенности каждой культуры: форму и размеры клеток, характер размножения, наличие вакуолей и липидных включений, количество неактивных и мертвых клеток. Зарисовывают клетки.

26

3. Определение количества клеток дрожжей. При определе-

нии числа различных клеток в 1 см3 суспензии используют счетную камеру Горяева–Тома. Для этого камеру покрывают покровным стеклом и притирают его к боковым пластинкам камеры до образования радужных колец Ньютона. Покровное стекло притирают для того, чтобы высота слоя исследуемой жидкости в камере была 0,1 мм. Точность определения количества клеток зависит от того, насколько плотно покровное стекло прилегает к поверхности камеры. Затем каплю исследуемой суспензии после тщательного перемешивания помещают под покровное стекло, после чего счетную камеру помещают на столик микроскопа и находят в поле зрения сетку. Ее легче находить при увеличении в 400 раз (окуляр 10, объектив 40). При этом увеличении в поле зрения микроскопа помещается один большой квадрат, состоящий из 16 маленьких квадратов (рисунок).

Камера Горяева

27

Подсчитывают все клетки, находящиеся внутри большого квадрата, а также на пограничных линиях, если клетки больше чем наполовину находятся в данном квадрате. Если клетки пересекаются пограничной линией пополам, то их считают только на двух смежных сторонах, например правой и верхней.

В каждом препарате подсчитывают клетки в пяти больших квадратах, находящихся по углам и в центре сетки. Если в густых суспензиях клетки считать трудно, их следует разбавить водой и пользоваться такими разведениями, при которых количество клеток в одном большом квадрате будет не более 30. Для получения достоверного результата необходимо сосчитать не менее 600 клеток

Объем одного большого квадрата во всех счетных камерах равен 1/250 мм3, следовательно, объем пяти квадратов равен 5/250 мм3. Чтобы определить количество клеток в 1 см3 (или 1000 мм3) исследуемой суспензии, нужно среднюю сумму количества клеток в пяти больших квадратах умножить на 50 000.

Число клеток дрожжей в 1 см3 суспензии удобно определять по формуле

Х = А∙50 000∙В,

где А – сумма клеток в пяти больших квадратах; В – разведение суспензии дрожжей; 50 000 – коэффициент пересчета объема пяти больших квадратов на 1 см3.

Для подсчета клеток можно использовать другую формулу, позволяющую выражать полученный результат сразу в млн кл/ см3 :

X 20nK ,

где Σn – сумма количества клеток в пяти квадратах сетки; K – разбавление исходной суспензии.

Подсчитывают в суспензии количество клеток (в процентах) с различными морфологическими характеристиками. Записывают полученные результаты.

4. Определение размеров клеток. Размеры клеток измеряют при помощи окулярного микрометра (1 мм состоит из 10 делений). Его помещают в диафрагму окуляра. Для определения истинной величины клеток необходим поправочный коэффициент, который устанавливают

28

с помощью объектного микрометра с делениями 1 мм на 100 частей (одно деление равно 10 мкм). Объектный микрометр помещают на столик микроскопа и определяют, какое количество окулярных и объектных делений помещается на отрезке от окулярного нуля до ближайшего совпадения черточек. В данном случае одно деление окулярного микрометра равно 4 мкм, т. е. 20 : 5.

При микроскопировании препарата дрожжей с тем же объективом и окуляром, при которых определяли поправочный коэффициент, измеряют длину и ширину клеток. Замеряют обычно 50–100 клеток, затем средний показатель умножают на поправочный коэффициент. При определении размеров клеток определяют их минимальные, средние и максимальные размеры.

Для облегчения работы можно пользоваться не объектным, а окулярным микрометром, определяя цену деления его шкалы при использовании различных окуляров и объективов (таблица).

5. Изучение морфологии колоний дрожжей. Для этого следует описать колонии дрожжей, выросших на поверхности плотной питательной среды в чашках Петри. При описании колоний отмечают: их вид; размер (мелкие, крупные); форму (круглые, неправильные); пигментацию (белые, беж, серые, розовые, красные); характер поверхности (гладкая, складчатая, морщинистая, блестящая, матовая); профиль (плоские, выпуклые); узор (однородные, пятнистые, радиально исчерченные). Морфологию колоний дрожжей изучают при помощи лупы. При просмотре колоний в световом микроскопе (с увеличением окуляра 10, объектива 10, бинокулярной насадки 2,5) следует определить и зарисовать наличие мицелия или псевдомицелия.

29