о --------- о
в9
Таким чином, міцні плеяди зв'язків характерні для мікобіоти клімаксних систем або для біогеоцвкозів у непорушеному стані.
Завдяки тому, що фунт є місцеіснуванкям численних видів мікро організмів, він відіграв важливу роль у збереженні біорізноманіття мікробіоти. Наведені вище дані стосовно видового складу прокаріотів і грибів у ґрунтах різних типів були отримані традиційним методом посіву ґрун тової суспензії на поживні середовища з наступним виділенням чистих культур мікроорганізмів і визначенням їх таксономічного положення за морфологічними І фізіологічними ознаками.
У сучасній екологічній літературі одним із найактуальніших є питан ня збереження видового різноманіття природи, існує міжнародна про грама зі збереження біорізноманіття. Важливою складовою цієї про грами є збереження біорізноманіття мікробіоти ґрунту. Угруповання з високим видовим багатством є більш стійким до змін умов існування, тому що воно може реагувати на ці зміни більш різноманітними спосо бами, порівняно з угрупованням з малим числом видів.
Основною перешкодою у вивченні видового різноманіття мікроор ганізмів є те, що дослідник має справу з частиною угруповання. Дані стосовно видового складу прокаріотів і грибів у різних середовищах пе реважно були отримані традиційними методами виділення чистих куль тур і визначенням їх таксономічного положення. Проте далеко не всі мікроорганізми культивуються на штучних середовищах. У 1956 р. гол ландський дослідник А. КлюЙвер передбачив, що половина існуючої на Землі живої протоплазми належить клітинам мікроорганізмів. На сучас ному етапі ця гіпотеза отримала експериментальне підтвердження. Ви користання молекулярних методів досліджень показало, що кількість виділених чистих культур мікроорганізмів у відношенні до їх чисельності у природі становить менше 0,1%. Були проведені підрахунки, згідно з якими за умов Існуючої швидкості відкриття і опису нових видів усі рос лини І тварини будуть описані протягом найближчих 50 років, тоді як на опис усіх видів мікроорганізмів знадобиться 10 000 років.
Останнім часом усе більш популярними є методи вивчення біоріз номаніття мікробного населення ґрунту без виділення чистих культур мікроорганізмів. Зокрема, використовують метод мультисубстратного тестування для визначення метаболічного потенціалу угруповань. Суть цього методу полягає у тому, що на планшеті в окремі лунки нанесені різні поживні субстрати: вуглеводи, ліпіди, білкові субстрати, а також
66
тест на дихання з використаним люмінесцентних солей тетразолію. У кожну лунку вносять водну суспензію ґрунту. Якщо угруповання рІЗ' кяться за фізіологічними властивостями, то вони будуть метаболізувати різні поживні субстрати, що дасть певну картину засвоєння нанесених у лунки субстратів.
Інтенсивно розвивається молекулярна екологія, яка базується на принципі вивчення біорізноманіття мікроорганізмів із застосуванням аналізу окремих елементів їх генетичного матеріалу. Найбільш пошире ним є експериментальний підхід рибосомної філогенетики, яка вивчає філогенетичні характеристики мікроорганізмів шляхом порівняння пер винної структури послідовностей рибосомиих генів або їхніх продуктів - рибосомальної РНК (рРНК). Найбільш поширеним маркером є ген РНК малої субодиниці рибосоми - Іб Б гЯІМА (рРНК). Застосування рибосом ної філогенетики для вивчення мікробних угруповань базується на тому припущенні, що кожний член угруповання має свій унікальний тип послі довностей гена 168 гіЗДА (168 гШ А ).
При вивченні угруповання не на рівні окремих цілих клітин, а на рів ні елементів № геномів був запропонований термін філотип, який озна чає специфічну послідовність генів для окремого члена мікробного угру повання. Визначення присутності філотипу не залежить від можливос тей Його культивування в умовах лабораторії.
Серед методів молекулярної екології переважають такі:
•сіквенс-аналіз: екстракція з ґрунту нуклеїнових кислот (ДНК, РНК) з наступною ампліфікацією фрагментів гену 16$ рРНК за допомо гою полімеразної ланцюгової реакції і вивчення ампліфікованих фраг ментів молекулярно-генетичними методами;
•дослідження екстрактів ДНК із різних середовищ за допомогою методу реасоціації та диференційного центрифугування в градієнті СєСІ;
•дослідження екстрагованих із середовищ нуклеїнових кислот методом гібридизації з олігонуклеотидними маркерами (ДНК і РНКзондами, міченими флуоресцентними барвниками);
•метагеномний метод, при якому тоную ться і аналізуються ве ликі фрагменти ДНК і метод експресійного клонування. Ці методи дають можливість виявляти не тільки гени Іб в рРНК, але й структурні гени,
відповідальні за роботу окремих ферментів.
Схема використання молекулярно-біологічних методів для аналізу мікробних угруповань представлена на рис. 5.3.
67
Рис. 5.3. Схема використання молекулярно-біологічних методів для аналізу мікробних угруповань баз виділення чистих культур (за Т.П. Туровою, 2004р.)
Найбільш важливими етапами сіквенс-аналізу є наступні:
1. Виділення сумарного препарату нуклеїнових кислот {РНК+ ДНК). Необхідно ретельно відділити фракцію клітин від органічних і не органічних компонентів середовища, що особливо важко зробити для такого середовища, як ґрунт. Крім того, слід визначити параметри отри мання безклітинного екстракту, оскільки клітинні стінки різних мікроор ганізмів потребують різних методів руйнування.
2. Отримання сумарної фракції генів 168 гіЗДА або 168 гОИД, в якій будуть репрезентативно представлені гени 168 гШ А або 168 гОІМА
68
кожного з членів угруповання. Використовують рестрикцію ДНК екдонуклеазами. Можна отримувати ПЛР-амплІфікати генів 16S rRNA без рес трикції ДНК. Для цього використовують специфічні пари праймерів (прямого і зворотнього), що є комплементарними консеративним ділян кам на 5- і З-кінцях гену.
3.Розподіл фракції iDNA на окремі гени. Для оцінки різноманіття філотипів необхідно розділити фракцію генів 16S rRNA на молекули, які ідентичні за довжиною, але різняться первинною структурою. Для цього використовують спосіб розділу ҐІЛР-ампліфікатів за допомогою молеку лярного клонування у клітинах Е.соІі. Застосовують також градієнтні гель-електрофорези (температурний або денатуруючий), внаслідок чого отримують електрофоретичний профіль, у якому кожна смужка у поліакриламідному гелі відповідає якомусь члену угруповання.
4.Аналіз генів 16S rRNA. Точність виконання цього етапу залежить від точного групування ідентичних клонів, що зумовлене набором взятих
удослід рестриктаз окремих клонів. Використовують метод отриман ня рекомбінантних DNA. Для цього проводять рестрикцію DNA ендонуклеазами. Фрагменти DNA, що утворилися, встроюють у плазмідний або фаговий вектор і кпонують у клітини Есоїі. У наступному скринікгу отри маної бібліотеки вибирають ті клони, які містять вставки генів 16S rRNA. Після визначення послідовностей 16S rRNA їх порівнюють із послідов
ностями, що є у банку даних. Це дає можливість визначення філогентичного положення членів угруповання. Для розпізнавання рідких і нових видів мікроорганізмів із ЛЛР виключають найбільш поширені послідов ності шляхом їх зв’язування зі специфічними пептидами.
Як приклад, на рис. 5.4 наведені результати філогенетичного аналі зу мікробного угруповання ґрунту. Було проведено 99 сіквенсів, внаслі док чого отримано риботипи (філотипи), що відповідали таким класам:
Bacteroides, Sphingabacteria, Proteobacteria. Firmicutes, Baciltus,
Acidobacteria, Nrtrospirae. Ane більшість типів залишились некласифікованими.
В молекулярній екології застосовують також гібридизаційний аналіз Із використанням генних зондів. Створені генні зонди двох типів: філо генетичні і функціональні. Філогенетичні молекулярні зонди можуть бути використані 1) для препаратів ДНК і РНК, що виділені зі зразків пе вних екологічних середовищ або 2) для фіксованих цілих клітин. Вико ристовують зонди, які здатні гібридизуватися з різкими ділянками послі довностей рибосомних генів малої 16S rRNA І великої 23S rRNA. Ство рені зонди, що є специфічними на різних таксономічних рівнях - від окремого виду (видові зонди) до усього мікросвіту (пан-зонди).
69
Гг іЧпЕігїгті· : Дірка иМ К Ь ім
П гп іп м , в к М
Р » М » с« ігііі С м |
ИЬііЬ' |
М ІЩ ^Іг»; МйгОірІгі
ЦкІшКМ
—МІ* -МТІ
_1 І·..МІРм»
» м
Рис. 5.4. Результати філогенетичного аналізу мікробного угруповання фунту
70