Материал: vse_metody_MIKROB

МЕТОДИЧЕСКИЕ УКАЗАНИЯ К ЗАНЯТИЮ

1. Виды микроскопии, используемые в медицинской микробиологии.

Для диагностики инфекционных заболеваний используют световой, тем-

нополевой, фазово-контрастный, люминесцентный и электронный микроскопы.

Общее увеличение микроскопа определяют произведением увеличений

объектива и окуляра.

Разрешающая способность микроскопа – это наименьшее расстояние между двумя точками, при котором они видны раздельно.

СВЕТОВОЙ МИКРОСКОП.

Разрешающая способность 0,2 мкм.

Предназначен для изучения формы, размеров и структуры окрашенных клеток.

При исследовании микроорганизмов применяют иммерсионный объек-

тив. Его преимущество – с помощью иммерсионного масла устанавливается оптически однородная среда с одинаковым показателем преломления между стеклом и линзой. Благодаря этому все лучи, не преломляясь и не изменяя на-

правления, попадают в объектив, чем достигается более высокая разрешающая способность. В качестве иммерсионного масла обычно используют кедровое или касторовое, показатель преломления которых равен показателю преломле-

ния света в стекле.

ТЕМНОПОЛЕВОЙ МИКРОСКОП (ультрамикроскоп).

Разрешающая способность – 0,02-0,04 мкм.

Предназначен для изучения формы, размеров и подвижности живых, неок-

рашенных бактерий.

Темное поле создается с помощью специального конденсора, в котором за-

темнена центральная часть и таким образом создается боковое освещение. По-

этому в объектив попадают лучи, отраженные от объекта. Увеличение разре-

2

шающей способности микроскопа связано с тем, что отраженный луч имеет бо-

лее короткую длину волны.

ФАЗОВО-КОНТРАСТНЫЙ МИКРОСКОП.

Разрешающая способность – 0,2 мкм.

Предназначен для изучения формы, подвижности и структуры живых не-

окрашенных бактерий.

Имеет специальный набор фазовых объективов и соответствующих им кольцевых диафрагм конденсора. С помощью этого устройства достигается преобразование невидимых фазовых колебаний преломленного луча в видимые амплитудные колебания.

ЛЮМИНЕСЦЕНТНЫЙ МИКРОСКОП.

Разрешающая способность – 0,2 мкм.

Предназначен для экспресс-диагностики вирусных и бактериальных ин-

фекций.

Люминесцентная микроскопия основана на способности некоторых ве-

ществ светиться под действием коротковолновых ультрафиолетовых (УФ) лу-

чей. Препараты для люминесцентной микроскопии окрашивают специальными люминесцентными красителями – флуорохромами (акридиновый оранжевый,

аурамин и др.). В качестве источника УФ-света обычно используют ртутно-

кварцевую лампу. Под действием УФ-излучения окрашенные клетки начинают светиться красным или зеленым светом.

ЭЛЕКТРОННЫЙ МИКРОСКОП.

Разрешающая способность – менее 1Å (Å – ангстрем).

Предназначен для изучения строения вирусов, бактерий и отдельных мак-

ромолекул.

Высокая разрешающая способность достигается малой длиной волны электронов. В электронном микроскопе вместо света используют поток элек-

3

тронов в безвоздушной среде. Источником электронов является вольфрамовая нить катода, разогреваемая до высокой (2500-29000С) температуры. Роль опти-

ческих линз выполняют электромагниты. Для исследования препаратов в элек-

тронном микроскопе применяют специальные пленки, проницаемые для элек-

тронов.

2.Техника приготовления и окрашивания бактериологического препара-

та. Принцип простого и сложного методов окраски.

Этапы приготовления мазка:

1.Собственно приготовление мазка.

2.Высушивание.

3.Фиксация.

4.Окрашивание.

1.Собственно приготовление мазка:

из культуры бактерий, выращенной в жидкой питательной среде:

-обезжирить предметное стекло;

-нанести на стекло с помощью бактериологической петли каплю культуры

ираспределить ее параллельными движениями;

из культуры бактерий, выращенной на плотной питательной среде:

-на обезжиренное стекло нанести каплю физиологического раствора, за-

тем внести в эту каплю петлей небольшое количество культуры бактерий с

плотной питательной среды и распределить параллельными движениями.

2.Высушивание мазка на воздухе или высоко над пламенем спиртовки (в

струе теплого воздуха).

3.Фиксация мазка:

жаром, в пламени спиртовки – при изучении формы и расположения бакте-

рий и дифференциации их при окраске сложным методом;

4

химическим методом – при изучении нативных (сохранивших естественную структуру) препаратов от больного (кровь, ликвор, гной и т.д.). В качестве хи-

мических фиксаторов чаще используют этиловый и метиловый спирт, а также смесь Никифорова (смесь этилового спирта и эфира в соотношении 1:1).

Цель фиксации:

-убить микроорганизмы;

-прикрепить их к предметному стеклу;

-улучшить их прокрашивание.

4.Окрашивание препарата простым и сложным методом.

Простой метод окраски позволяет изучать форму, размеры и взаиморас-

положение бактерий. Для окраски используют только один краситель, чаще фуксин Пфейффера или метиленовый синий.

Принципиальный рецепт простого водно-спиртового красителя:

1 часть красителя

+

10 частей 96о этилового спирта

+

100 частей дистиллированной воды

Сложные методы окраски позволяют дифференцировать микроорганизмы

(окраска по Граму, Цилю-Нильсену) или видеть отдельные структуры клеток

(окраска по Бурри-Гинсу, Нейссеру, Романовскому-Гимзе). Для окраски ис-

пользуют более одного красителя.

3. Окраска по Граму. Примеры грамположительных и грамотрицательных

бактерий. Механизм окраски.

Окраска по Граму (в модификации Синѐва):

-на фиксированный мазок накладывают фильтровальную бумагу, пропитан-

ную генциан-фиолетовым, смачивают водой, окрашивают 2 минуты;

5

-снимают бумагу и наносят на мазок раствор Люголя на 1 минуту, затем кра-

ситель сливают;

-обесцвечивают мазок 96о спиртом 10-15 секунд;

-промывают мазок водой;

-докрашивают мазок фуксином Пфейффера 30 секунд;

-промывают мазок водой, высушивают фильтровальной бумагой и микро-

скопируют.

Механизм окраски по Граму.

Дифференцировка на грамположительные и грамотрицательные бактерии зависит от строения клеточной стенки, основой которой является пептидогли-

кан. У грамположительных бактерий толщина пептидогликана 500Å, у грамот-

рицательных – не более 150Å.

При окрашивании препарата генциан-фиолетовым, а затем раствором Лю-

голя, образуется комплекс генциан-фиолетовый + йод. Все клетки окрашивают-

ся в сине-фиолетовый цвет. При обработке спиртом у грамположительных бак-

терий образовавшийся комплекс не обесцвечивается. Поэтому при окрашива-

нии фуксином Пфейффера они сохраняют сине-фиолетовый цвет. У грамотри-

цательных бактерий комплекс генциан-фиолетовый + йод обесцвечивается спиртом и при окраске фуксином Пфейффера они приобретают розово-красный цвет.

В результате окраски бактерии дифференцируют на грамположительные

(сине-фиолетовые) или грамотрицательные (розово-красные).

К грамположительным относят все кокки (кроме нейссерий) и спорообра-

зующие бактерии. К грамотрицательным – нейссерии, неспорообразующие бак-

терии, спириллы.

6