Автореферат: Возрастная модуляция фенотипической пластичности гипоталамо-гипофизарно-надпочечниковой системы при хроническом действии стрессоров

У экспериментальных животных обеих экспериментальных подгрупп всех возрастных групп обнаружены признаки стресса: акцидентальная инволюция тимуса (в младших группах), гипертрофия надпочечников и кровоизлияния/изъязвления на слизистой оболочке желудка, а также уменьшение массы тела по сравнению с контрольными животными (p<0,05 при действии гетеротипического стрессора). Динамика относительной массы гипофиза показала достоверное ее снижение с возрастом и повышение при обоих видах стресса у подавляющего большинства возрастных групп (рис.4). При этом у стареющих животных уровень повышения при действии гомо- и гетеротипических стрессоров различался меньше, чем в младших возрастных группах. Относительная масса надпочечников снижалась у контрольных животных с возрастом и достоверно повышалась у крыс всех возрастных групп обеих экспериментальных подгрупп с наибольшей амплитудой повышения у стареющих животных (рис.5).

Возрастная динамика морфологии надпочечников крыс достаточно подробно описана в литературе [L.K.Malendowicz, 1987; P.Rebuffat et al., 1992]. При хроническом стрессе у животных отмечается выраженная гипертрофия коркового вещества надпочечников, главным образом за счет гипертрофии и гиперплазии губчатых кортикостероцитов, особенно граничащих с сетчатой зоной, что свидетельствует о повышении функциональной активности коры надпочечников, в частности клеток пучковой зоны [T.Milovanovic et al., 2003]. Корково-мозговое соотношение - адекватный показатель степени гипертрофии коры надпочечника - флуктуировал у контрольных крыс с возрастом и значимо увеличивался в группе стареющих животных (p<0,05), у которых он больше всего возрастал и при обоих видах стресса (p<0,01). Увеличение данного показателя было достоверно у неполовозрелых животных с разным уровнем значимости при действии гомо- и гетеротипического стрессора (p<0,05 и p<0,01 соответственно) и с одинаковым уровнем значимости при действии разных видов стресса у молодых и зрелых особей (p<0,05) (рис.6). Иммуногистохимическое окрашивание на белок S100 выявляет популяцию поддерживающих клеток мозгового вещества, количество которых считается косвенным показателем симпато-адреналовой системы [S.S.Sternberg, 1996; S.Diaz-Flores et al., 2008]. Иммунореактивные клетки в мозговом веществе надпочечников контрольных животных выявлялись в виде тонких отростчатых образований, нередко переплетающихся своими отростками, количество которых имело тенденцию увеличиваться с возрастом, достигая значимости различий у 6-месячных (p<0,05) и 12-месячных (p<0,01) крыс. Перенесенный стресс практически не влиял на относительную численность данной клеточной популяции в старшей возрастной группе и незначительно изменял ее долю в раннем возрасте, однако у молодых и зрелых животных отмечено достоверное снижение данного показателя (p<0,05) при действии гетеротипического стрессора, что позволяет косвенно судить о степени стресс-ассоциированной активации симпато-адреналовой системы в определенные возрастные периоды.

В аденогипофизе при хроническом стрессе у животных обеих экспериментальных подгрупп всех четырех возрастных групп отмечались микроциркуляторные нарушения в виде полнокровия капилляров и венул, гипертрофия эндокриноцитов, увеличение числа и доли базофильных клеток (более характерное для животных первых трех возрастных групп), усиление фолликуло- и кистообразования, особенно характерное для животных двух старших возрастных групп. С возрастом доля кортикотропоцитов в дистальной части аденогипофиза возрастает (начиная с 6-месячного возраста - высоко достоверно, p<0,01) (рис.7). Увеличение удельной площади кортикотропоцитов достоверно при действии гомотипического стрессора (p<0,05) и высоко достоверно при действии гетеротипического стрессора (p<0,01 для неполовозрелых и молодых экспериментальных животных; p<0,001 для животных зрелого возраста), у 12-месячных крыс данный показатель увеличивается незначительно.

Митотическая пластичность аденогипофиза оценивалась при окрашивании PCNA. Отмечено, что доля иммунореактивных клеток в целом невелика, они достаточно равномерно распределены по территории аденогипофиза, однако в латеральных крыльях их плотность несколько выше, чем в базофильном клине [S.S.Sternberg, 1996]. Количество иммунореактивных клеток с возрастом имеет тенденцию к уменьшению. У экспериментальных животных этот показатель незначительно увеличивался во всех возрастных группах при обоих видах стресса, однако достоверным увеличение было только при действии гомотипического стрессора у животных неполовозрелого и молодого возраста (p<0,05 и p<0,01 соответственно) (рис.8).

фенотипическая пластичность надпочечниковый стрессор

Окрашивание на каспазу-3 показало, что количество иммунореактивных клеток в целом сопоставимо с количеством PCNA-позитивных клеток. Данный показатель был подвержен значительным индивидуальным колебаниям. С возрастом число иммунореактивных клеток несколько увеличивается, достигая уровня значимости в группе стареющих крыс (p<0,05). Хроническое действие гетеротипического стрессора высоко достоверно (p<0,01) у неполовозрелых животных и достоверно (p<0,05) у крыс остальных возрастных групп вызывает увеличение данного показателя. При гомотипическом стрессе изменение доли иммунореактивных клеток не было достоверным у молодых и зрелых животных, для неполовозрелых и стареющих особей вероятность увеличения составила >99,95% (рис.9).

Окрашивание на ED1 выявило неожиданно много иммунореактивных клеток в аденогипофизе. Эти клетки были крупными по размеру, значительно большим, чем у фолликулярнозвездчатых клеток. У контрольных крыс в неполовозрелом возрасте доля ED1+клеток была достоверно ниже, чем у молодых (p<0,05), зрелых (p<0,01) и стареющих (p<0,001) животных. При хроническом действии гомотипического стрессора она достоверно повышалась у стареющих животных (p<0,01), а гетеротипического - еще и у неполовозрелых c одинаковым уровнем значимости (p<0,05) и 6-месячных (p<0,01) (рис.10).

Окрашивание на белок S100, специфически выявляющее в аденогипофизе фолликулярнозвездчатые клетки, показало, что в неполовозрелом возрасте эти клетки немногочисленны, как правило, они не имеют формы звездчатых; чаще всего это мелкие округлые клетки, равномерно распределенные по паренхиме железы, расположенные поодиночке вне связи с фолликулами, которые в данной возрастной группы встречаются не часто. С возрастом их число неуклонно возрастает (p<0,05; p<0,01 и p<0,001 при сравнении неполовозрелых контрольных животных с молодыми, зрелыми и стареющими соответственно) (рис.11), и они начинают приобретать угольчатую форму. В стареющем организме они становятся отчетливо звездчатыми, образуют скопления, как в связи с фолликулами, так и за их пределами. При действии гомотипического стресса у неполовозрелых и молодых животных данный показатель достоверно уменьшается (p<0,05), у зрелых животных он снижается незначительно, в то время как у стареющих он повышается, причем в обеих экспериментальных подгруппах. При действии гетеротипического стрессора данный показатель значимо уменьшается в неполовозрелом периоде (p<0,001), молодом (p<0,01) и зрелом возрасте (p<0,05). Обнаружение столь разнообразной и разнонаправленной динамики данной клеточной популяции в разных возрастных группах дает нам основание оценить вклад фоллликулярнозвездчатых клеток в определении секреторной пластичности аденогипофиза и адаптации центрального звена ГГАО к хроническому стрессу.

Изучение морфологических и иммуногистохимических особенностей ПВЯ гипоталамуса производилось на гистологических срезах, произведенных в соответствии с рекомендациями G.Paxinos и С.Watson (2007) для головного мозга крыс разных возрастных групп. В исследуемых препаратах отмечено, что хронический стресс вызывает изменения в нейронах мелкоклеточной фракции ПВЯ гипоталамуса, которые заключаются в их гипертрофии, гипертрофии их ядер, повышении доли деконденсированного хроматина и увеличении размера и количества ядрышек. Имидж-анализ показал, что удельная площадь КРФ-иммунореактивных клеток в ПВЯ имеет возрастную тенденцию к увеличению и максимальных значений она достигает у стареющих крыс (p<0,001); однако при хроническом стрессе амплитуда увеличения данного показателя в обеих экспериментальных группах этого возраста - минимальная среди возрастных подгрупп, хотя и достигает уровня значимости (p<0,05). У неполовозрелых животных отмечен более высокий уровень различий с контролем при действии гетеротипического стрессора по сравнению с гомотипическим (соответственно p<0,01 и p<0,05). В молодом и зрелом возрасте данный показатель достоверно увеличивался при действии гетеротипического стрессора, однако гомотипический стрессор вызывал лишь незначительное его повышение (рис.12). Данный показатель является чрезвычайно важным для оценки функционального состояния ГГАО, так как дает возможность судить и о респонсивности, и о фасилитации/габитуации, и об эффективности отрицательной обратной связи, однако для этого необходимо сопоставление данного показателя с индексами активации других звеньев ГГАО.

Корреляционный анализ продемонстрировал наличие средней по силе достоверной обратной корреляционной связи между корково-мозговым соотношением в надпочечнике и экспрессией КРФ в гипоталамусе у животных молодого и зрелого возраста соответственно при действии гомотипического стрессора (r=-0,68, p<0,05 и r=-0,63, p<0,05), в то время как в других возрастных группах при гомотипическом стрессе и во всех возрастных группах при гетеротипическом стрессе она была слабой или недостоверной. Таким образом, эффективность отрицательной обратной связи ГГАО и определяющая ее секреторная пластичность гипоталамуса имеет возрастную детерминанту и зависит от типа действующего хронически стрессора.

Корреляционный анализ использовался нами и при определении связи между динамикой клеточных популяций кортикотропоцитов и фолликулярнозвездчатых клеток в аденогипофизе. Оказалось, что сильная обратная корреляционная связь отмечалась между удельной площадь АКТГ- и белок S100-иммунореактивных клеток при действии гомотипического стрессора в молодом возрасте, средняя по силе достоверная связь между этими показателями у неполовозрелых особей и животных зрелого возраста (r=-0,72, p<0,05 и r=-0,64, p<0,05). В остальных группах связь была слабой и недостоверной. Таким образом, продемонстрировано, что численность клеточной популяции фолликулярнозвездчатых клеток и кортикотропоцитов

взаимообусловлены, что свидетельствует о возможном участии фолликулярнозвездчатых клеток в дифференцировке кортикотропоцитов и, таким образом, при определенных уровнях стресс-ассоциированной активации, их способности онтогенетически опосредованно обеспечить адаптационный уровень пластичности центрального звена ГГАО.

Таким образом, предпринятое исследование, проведенное с применением разнообразных тестов активации ГГНС при хроническом стрессе: поведенческих, морфологических, иммуногистохимических позволило выявить закономерности адаптационных изменений на разных уровнях ГГАО в возрастном аспекте в различных форматах хронического стрессорного воздействия. В большинство используемых в настоящее время моделей хронического стресса применены гомотипические стрессоры, вызывающие габитуацию стрессорного ответа [A.Armario et al., 2008]. Вместе с тем организм современного человека в большей степени подвержен действию постоянно меняющихся гетеротипических стрессоров, которые характеризуются иными закономерностями активации ГГНС, значительно отличающимися от привычных гомотипических моделей стресса с их фасилитацией респонсивности ГГАО [I.Z.Mathews et al., 2008; N.Grissom et al., 2009; T.M.Segar et al., 2009; J.H.Winston et al., 2010]. Сравнительное изучение адаптации разных звеньев ГГНС при действии гомо- и гетеротипических стрессоров позволило нам продемонстрировать возрастную динамику пластичности ГГАО с ее снижением в период старения организма, однако адаптационный потенциал в этот возрастной период, несмотря на нарушение отрицательной обратной связи, все еще достаточно адекватен даже при действии жестких стрессоров; и изменений, соответствующих посттравматическому синдрому с гипокортицизмом и атрофией коры надпочечников, отмеченных другими исследователями при хроническом стрессе у старых животных [В.Г.Шаляпина и др., 2005; T.M.Segar et al., 2009], в данной возрастной группе не наблюдается; при этом особенности поведенческого дефицита у животных данного возраста показывают, что нарушение пластичности ГГНС увеличивает подверженность стресс-ассоциированной неврологической патологии [G.Dagyte et al., 2009].

Предпринятое исследование выявило определенные закономерности динамики клеточных популяций аденогипофиза: кортикотропоцитов, вспомогательных клеток (макрофагальных и фолликулярнозвездчатых), а также показало диапазон митотической и апоптотической пластичности эндокриноцитов передней доли гипофиза при хроническом стрессе в разных возрастных группах. При этом распределение белок S100-позитивных клеток в дистальной части представляется чрезвычайно важным для нашего исследования. Ряд исследователей считают, что они выполняют лишь функцию скевенджеров [C.Luziga et al., 2006]. Если принять эту точку зрения, то становится трудно объяснить обнаруженное нами наличие столь многочисленной популяции зрелых макрофагов, которые практически дублируют функции скевенджерных фолликулярнозвездчатых клеток. Наше исследование поддерживает точку зрения тех исследователей [E.Horvath et al., 2002], которые считают, что фолликулярнозвездчатые клетки являются орган-специфическими стволовыми клетками, и выявленная нами их возрастная и стресс-ассоциированная динамика позволяет сделать заключение о роли этих клеток в пластичности аденогипофиза как центрального звена ГГНС при хроническом стрессе.

ВЫВОДЫ

1. Хронический стресс индуцирует изменение диапазона фенотипически определенных адаптационных сдвигов в гипоталамо-гипофизарно-надпочечниковой системе, определяемое типом примененного стрессора (гомотипического или гетеротипического) и исходным возрастом экспериментальных животных и отражающееся в модификации поведенческой активности с формированием поведенческого дефицита в виде тревожных состояний у животных раннего, молодого и зрелого возраста и депрессивно-подобного поведения в стареющем организме.

2. Уровень экспрессии кортикотропин-рилизинг фактора в паравентрикулярном ядре гипоталамуса и ее связь с респонсивностью периферического звена гипоталамо-гипофизарно-адренокортикальной оси характеризуют пластичность центрального звена гипоталамо-гипофизарно-надпочечниковой системы, которая определяется возрастом экспериментальных животных, модулируется типом примененного стрессора и влияет на поведенческую активность. В молодом и зрелом возрасте она обеспечивает дифференцированный ответ при действии хронического стресса с применением разного типа стрессоров (гомо- или гетеротипических).

3. В стареющем организме пластичность гипоталамического звена гипоталамо-гипофизарно-надпочечниковой системы значительно снижается, что подтверждается высоким уровнем экспрессии КРФ при действии обоих видов стрессоров, не зависимым от уровня активности коры надпочечников и свидетельствующим о предотвращении адаптивной десенситизации гипоталамо-гипофизарно-адренокортикальной оси, характерной для хронического действия гомотипического стрессора.