Материал: Учебное пособие для высших сельскохозяйственных учебных заведений по специальности Ветеринарная медицина

Определение ингибирующих веществ в молоке
Ингибирующими веществами, попадающими в молоко, чаще всего могут быть антимик-

157 робные и дезинфицирующие средства. Первые выделяются молочной железой при различных способах применения больным.животным, в том числе и при интрацистернальном введении.
Вторые попадают в сборное молоко в результате недостаточного отмывания проточной водой доильного оборудования и молочной посуды. а) С индикатором резазурином.
Метод основанна восстановлении резазурина при развитии в молоке чувствительного к ингибирующим веществам микроба вида Stгерtососсus thermophilus.
Приготовдение коллекционной тест-культуры:
В пробирку с 10 мл стерильного обезжиренного молока вносят одну петлю культуры
Stгерtососсus thermophilus и выдерживают в термостате при температуре 42-43°С в течение 16-18 ч. Коллекционную тест-культуру хранят при температуре 6-8°С и перевивают через 10-14 суток.
Приготовление рабочей тест-культуры:
В пробирку с 10 мл или баночку со 100 мл обезжиренного молока вносят соответственно 1 петлю или I мл коллекционной тест-культуры и выдерживают в термостате при температуре 42-
43°С в течение 16-18 ч.
Проведение анализа:
Для анализа используют 1-2-суточную рабочую тест-культуру при условии хранения ее в холодильнике при температуре 6-8°С.
В чистые пробирки наливают по 10 мл исследуемого молока и закрывают стерильными резиновыми пробками. Оставшуюся часть пробы молока сохраняют в холодильнике при темпера- туре 6-8°С. Одновременно проводят контрольный анализ. Для этого в пробирку наливают 10 мл молока, свободного от ингибирующих веществ. Это молоко можно хранить в холодильнике при температуре 6-8°С не более суток. Пробирки с исследуемым молоком и контрольной пробой нагревают в водяной бане до 85-90°С, выдерживают 10 мин. затем охлаждают до 43-45°С. После этого в пробирки стерильной пипеткой вносят по 0,3 мл рабочей тест-культуры. Содержимое пробирок тщательно перемешивают путем трехкратного переворачивания и выдерживают при температуре 42-43°С в редуктазнике или водяной бане в течение 2 ч. После этого во все пробирки вносят по 1 мл 0,05% раствора резазурина с температурой не ниже 18-20°С. Содержимое пробирок тщательно перемешивают. Пробирки с исследуемым молоком и контрольной пробой выдержива- ют в редуктазнике или водяной бане при температуре 42-43°С в течение 15мин.
Учет результатов:
При отсутствии в молоке ингибирующих веществ (и в контрольной пробе) содержимое, пробирок будет иметь розовый или белый цвет.
При наличии в молоке ингибирующих веществ содержимое пробирок будет иметь сине- стальную, сине-фиолетовую иди фиолетовую, окраску.
Чувствительность метода позволяет обнаружить в молоке содержание пенициллина более
0,01 МЕ/мл, формалина около 0,005%, перекиси водорода, более 0,01% б) С индикатором метиленовым голубым
Метод основан на восстановлении метиленового голубого при развитии в молоке чувстви- тельных к ингибирующим веществам микроорганизмов вида Stгерtососсus thermophilus.
Готовят коллекционную и рабочую тест-культуру.
Приготовление 3% водного раствора пептона. Проводятпо рецепту 14.
Приготовление 0,5% раствора метиленового голубого. 500 мг метиленового голубого по- мещают в колбу, доливают до 100 мл дистиллированной кипяченной водой, перемешивают до полного растворения, плотно укупоривают и хранят в холодильнике при температуре 6-8°С не более 30 суток.
Приготовление смеси для анализа:
К 20 мл 3% водного раствора пептона добавляют 3,5 мл односуточной культуры термо- фильного стрептококка (пипетку предварительно следует хорошо ополоснуть этой смесью) и 0,1 мл 0,5% водного раствора метиленового голубого. Смесь хороша перемешивают. Смесь готовят перед анализом.
Проведение анализа:
В чистые пробирки наливают по 10мл исследуемого молока и закрывают (неплотно) ре- зиновыми пробками. Оставшуюся часть пробы хранят в холодильнике при температуре 6-7°С в течение суток. Пробирки с молоком нагревают в водяной бане до температуры 85-90°С и выдер- живают 10 мин, затем охлаждают до 42-45°С. После этого впробирки вносят стерильной пипеткой по 2 мл приготовленной смеси, перемешивают путем трехкратного переворачивания пробирок и выдерживают в водяной бане при температуре 41-42°С в течение 1 ч 40 мин - 2 ч 20 мин.
Учет результатов:
При отсутствии в молоке ингибирующих веществ содержимое пробирок будет иметь бе- лый цвет.

158
При наличии в молоке ингибирующих веществ содержимое пробирок будет иметь голубой цвет. Голубое кольцо, образующиеся в пробирке на поверхности молока высотой 1 см, не учиты- вают.
Чувствительность метода позволяет обнаружить пенициллин от 0,01 до 0,1 МЕ/мл, стреп- томицин от 30-50 мкг/мл, тетрациклин, окситетрацикдин -1 МЕ/мл, олеандомицин -10 МЕ/мл, формалин - от 0,003 до 0,005%, перекись водорода от 0,01 до 0,1%.
Рецепты питательных сред
Рецепт 1
Кровяной агар цитратный
От здоровой коровы из яремной вены берут 250 мл крови в стерильную колбу с 50 мл сте- рильно приготовленного 5% раствора лимоннокислого натрия. По мере взятия кровь в колбе смешивают с лимоннокислым натрием. Полученную цитратную кровь проверяют на стерильность путем посева на МПБ и только после этого используют для приготовления кровяного агара, цит- ратную кровь можно сохранять в течение 10-15 дней в холодильнике. МПА расплавляют в колбе, затем охлаждают до 45°С и стерильной пипеткой вносят в него 10-15% цитратной крови, равно- мерно смешивая, после чего разливают в чашки Петри по 15 мл. Застывший агар помещают в термостат при температуре 37°С на 24 ч для проверки на стерильность.
Для приготовления кровяного агара можно использовать дефиб-ринированную кровь ба- рана.
Рецепт 2
ДНК-новокаиновыйагар
К 150 мл расплавленного стерильного З% МПА (рН 8,6) добавляют 150мг ДНК-натриевой соли, предварительно растворенной в 10 мл (подщелоченной 2 каплями 10% едкого натра) дис- тиллированной воды, 1 и 3 мл 2% раствора новокаина. После перемешивания среду прогревают в течение 30 мин в кипящей водяной бане. К остывшей до 45-50°С среде добавляют 7-8 мл 5% сыворотки крови крупного рогатого скота и 1,2 мл 10% стерильного раствора хлористого кальция, перемешивают и разливают в чашки Петри.
Рецепт 3
ДНК-агар
К 150 мл расплавленного 2% МПА (рН 8,6) добавляют 150 мг ДНК-натриевой соли, рас- творенной в 10 мл дистиллированной воды (подщелоченной 2 каплями 10% едкого натра). Среду прогревают 30 мин в кипящей водяной бане, затем охлаждают до 50-60°С и добавляют 1,2 мл 10% стерильного раствора хлористого кальция и 13-14 мл (8-9%) сыворотки крови крупного рогатого скота или 8 мл (5%) дрожжевого экстракта.
Рецепт 4
Среда Гисса с манитом
Приготовление индикатора Андраде:
0,5 г кислого фуксина растворяют в 100 мл стерильной дистиллированной воды, добавля- ют 16,4 мл 1н едкого натра, стерилизуют при 100°С 5 мин, хранят в темном месте с притертой пробкой.
К полужидкой пептонной среде (I% пептона, 0,5% хлорида натрия, 0,15%. агар-агар) с рН
7,4 после ее расплавления добавляют 0,5% манита и I% индикатора Андраде, перемешивают, разливают в пробирки по 10мл. Стерилизуют при 0,5 атм. 30мин, после чего наслаивают сте- рильное вазелиновое масло высотой 1 см.
Рецепт 5
Среда Карташовой
К 500 мл готового стерильного МПБ добавляют 2,5 г лактозы, 1 мл спиртово-водного раствора 1:100 бромкрезолпурина (после растворения 1 г порошка в 50 мл спирта добавляют 50 мл дистиллированной воды).
Колбу со средой ставят, в холодную водяную баню, доводят да кипения и кипятят 5-7 мин.
Охлаждают среду до 50-55°С и добавляют, 50 мл сыворотки крови и 50 Ед/мл неомицина. Среду разливают в стерильные пробирки по 5 мл.
Рецепт 6
ГлюкозныйМПБ
В 100 мл МПБ добавляют 1 г глюкозы, среду стерилизуют при 0,5 атм. В течение 30 мин.
Доводят рН среды до 7,2-7,4.
Рецепт 7

159
МПБ с желчью
К 90 мл стерильного МПБ (рН 7,4) добавляют асептический 10 мл стерильной бычьей желчи, перемешивают, разливают в пробирки и стерилизуют при 0,5 атм. 20 мин.
Рецепт 8
Молоко с метиленовым голубым
0,2 г метиленового голубого растворяют в 20 мл горячей дистиллированной воды, про- пускают через бумажный фильтр и стерилизуют при 0,5 атм. 20 мин. К стерильному обезжирен- ному молоку добавляют I% приготовленного раствора метиленового голубого.
Рецепт 9
Среда КОДА
Среда выпускается промышленным способом в виде порошка (Дагестанский НИИ пита- тельных сред) и готовится в соответствии с инструкцией.
Рецепт10
Среда Олькеницкого
К 100 мл стерильного питательного агара добавляют 1 г лактозы, 0,02 г соли Мора, 0,03 г гипосульфита, 1 г сахарозы, 0,1 г глюкозы, 1 г мочевины и 0,4 мл 0,4% раствора фенолового красного.
Предварительно растворяют соль Мора с гипосульфитом в одной пробирке с небольшим количеством воды, а в другой - мочевину с углеводами. После растворения содержимое обеих пробирок смешивают с агаром и фильтруют через стерильную марлю. Стерилизуют текучим паром 3 дня подряд по 20 мин. Горячую среду скашивают, оставляя столбик высотой 2 см. Среда прозрачная, имеет красный цвет с коричневым оттенком.
Рецепт 11
Элективная дифференциально-диагностическая среда
для выделения грибов рода Саndida
18-20 г агар-агара растворяют при кипячении в 500 мл дистиллированной воды, затем до- бавляют до 1 л фильтрат сусла, имеющего 6-8% карамели (солод пожаренный при 150-170°С в течение 2,5 ч). После установления рН 6,6-6,8 среду разливают в колбы и автоклавируют при 1 атм. 15 мин. для проверки стерильности среду ставят в термостат при температуре 37°С на 24 ч.
Стерильную среду нагревают до 100 °С и остывшую до 47-50°С разливают в чашки Петри или пробирки. Чашки со средой хранят в холодильнике до 15-30 дней в целлофановых пакетах с целью предотвращения высыхания.
Рецепт 12
Среда для анаэробной ферментации сахаров
Приготовление экстракта дрожжей:
25 г дрожжей растворить в 100 мл дистиллированной воды, прокипятить 45 мин, затем по- сле охлаждения центрифугировать при 3000 об/мин в течение 45мин. Слить в колбу и довести до кипения. Разлить в стерильные пробирки и поставить в термостат при 37°С на 24 ч.
На 1 л дистиллированной воды внести 10 г трипсина Дифко, 1 мл экстракта дрожжей, 10 г манита (глюкозы), 2 г агар-агара и 0,04 г бромкрезолпурина, довести до кипения, затем стерилизо- вать в автоклаве при 0,5 атм. в течение 20 мин. Разлить в пробирки до высоты 10-12 см.
Рецепт 13
Кровяной агар с эскулином
В 1мл МПБ вносят 5 г хлорида натрия, 1 г эскулина (получают из конского каштана), 20 г агар-агара.
В стерилизованную при 121°С среду в течение 15 мин с рН 7,4, охлажденную до 45-48°С, добавляют 50 мл дефибринированной крови барана, хорошо перемешивают и разливают в чашки
Петри. Чашки со средой выдерживают в термостате при 37°С в течение 24 ч с целью просушива- ния и проверки стерильности. Чашки хранят в холодильнике при температуре 4-б°С и используют в течение 15 дней со дня приготовления.
Рецепт 14
Водный раствор пептона
3 г пептона помещают в колбу и доливают до 100 мл водопроводной водой, стерилизуют при 121°С в течение 10 мин и хранят в холодильнике при температуре б-8°С в течение 30 суток.
Иммунологические методы исследования молока

160
Иммунологические факторы молока определяют локальную резистентность молочной же- лезы, ее сопротивляемость к развитию воспалительных процессов, коррелируют с фактором защиты всего организма и имеют особенности в зависимости от функционального состояния органа.
Определение лизоцимов молока по В.И.Мутовину
В основе выявления лизоцимов положен метод диффузии в агар и образования зоны за- держки роста (ЗЗР) тест-культуры микроба. На агаровую пластинку в чашке Петри наносят по 0.2 мл суточной бульонной тест-культуры и равномерно распределяют по всей поверхности. Выдер- живают 20-30 мин при комнатной температуре для пропитывания агара, а затем с помощью про- бойника диаметром 0,8-1 см делают 4 луночки, в которые вносят по 0,01 мл (2 капли) исследуемо- го молока. Чашки выдерживают при комнатной температуре (18-20°С) 30-40 мин, а затем 16-18 ч в термостате при температуре 36-38°С, после чего измеряют ЗЗР а) «Лизоцим молока» - ЛМ
В качестве тест-культуры используют золотистый стафилококк штамм ВМ- 57, выделен- ный из молока здоровой коровы.
Максимальный уровень ЛМ (25 мм и более) у здоровых коров на 2-6 месяцах лактации, у больных - понижен (менее 18 мм) или отсутствует (0). Термостабилен, разрушается при темпера- туре 70°С, в сыром молоке сохраняется до 10 дней при температуре 4-6°С. б) «Лизоцим вымени» - ЛВ
В качестве тест-культуры используют слезный микрококк Флеминга.
Не коррелирует с ЛМ, повышается уровень в молоке в конце лактации и у больных масти- том коров. В сыром молоке сохраняется до 10 дней при температуре 4-б°С. в) «Лизоцим колостральный» - ЛК
В качестве тест-культуры используют белый стрептококк штамм.
Максимальные концентрации ЛК в молозиве, через 10 дней после отела его уровень ниже уровня ЛМ. г) «Лизоцим термостабильный» - ЛТ
В качестве тест-культуры используют золотистый стафилококк штамм ВМ-57.
Выявляется в молоке стародойных коров после прогревания при температуре 70°С в тече- ние 30 мин и сохраняется до 1,5-2,0 мес., в сыром молоке сохраняется 5-7 дней д) «Лизоцим инверсионный» - ЛИ
В качестве тест-культуры используют розовый стафилококк штамм 56.
Отсутствует в молоке здоровых коров, обнаруживается в секрете пораженных маститом долей вымени. е) «Лизоцим основной» - ЛО
В качестве тест-культуры используют ацидофильную палочку штамм 17 т. Определяют методом серийных разведении. В разведения молока (молозива) вносят в объеме 10% суточную бульонную тест-культуру, выдерживают в термостате при температуре 37°С в течение суток, после чего учитывают рост.
В молозиве ЛО действует бактерицидно в разведении 1:10 000, на 10-й день после отела в молоке его антибактериальное действие проявляется в разведении 1:2-1:4, а у больных маститом коров ЛО несколько повышается.
Определение истинного лизоцима (мурамидазы)
а) Метод К. Шахани.
Подготовка к анализу:
1) Приготовление молочной сыворотки.
5 мл молока разводят равным объемом 0,5% раствора натрия хлорида и центрифугируют
10 мин при 2000 об/мин. Снимают слой жира, молоко подогревают до 37°С и доводят рН до 4,6 1н раствором соляной кислоты. Выпавший в осадок казеин отделяют центрифугированием в течение
10 мин при 2000 об/мин, а сыворотку фильтруют через бумажный фильтр.
2) Построение калибровочных кривых. Для построения калибровочных кривых исполь- зуют кипяченое молоко, в котором таким способом подавляется лизоцимная активность, а затем из него готовят молочную сыворотку.
В качестве тест-культуры используют убитых ультрафиолетовыми лучами и лиофилизи- рованных клеток Мусгососсus 1уsоdеiсticus,изкоторых готовят суспензию на 1/15 М фосфатном буфере с рН 6,2, экстинция которых должна составлять 10-30% против дистиллированной воды
(100%).
В два ряда пробирок с сывороткой молока по 3 мл вносят разные количества лизоцима (в первый ряд - от 0-20 мкг/100 мл, во второй - от 20-200 мкг/100 мл), затем добавляют по 3 мл свежеприготовленной клеточной суспензии тест-культуры и на спектрофотометре определяют

161 экстинцию (Д
0
) при длине волны 540 нм. После этого смесь инкубируют в термостате при темпе- ратуре 37°С в течение 20 мин и повторно определяют экстинцию (Д
20
). По разности экстинций (Д
0
и Д
20
) смеси отдельных пробирок и соответствия ей концентрации лизоцима строят две калибро- вочные кривые.
Проведение анализа:
К 3 мл сыворотки исследуемого молока добавляют 3 мл свежеприготовленной клеточной суспензии тест-культуры и сразу же определяют на спектрофотометре экстинцию (Д
0
) при длине волны. 540 нм. Затем смесь инкубируют в термостате при температуре 37°С в течение 20 мин и повторно определяют экстинцию (Д
20
).
По разности экстинций Д
0
и Д
20
по калибровочной кривой определяют концентрацию ли- зоцима. б) По методу Парри в модификации Хавигера
1) Приготовление молочной сыворотки.
5 мл молока центрифугируют 10 мин при 2000 об/мин, снимают слой жира, подогревают до 37°С и осаждают казеин, доводя рН до 4,6 путем внесения 1н раствора соляной кислоты. Казе- ин отделяют центрифугированием в течение 10 мин при 2000 об/мин, а сыворотку фильтруют через бумажный фильтр и разводят физиологическим раствором в соотношении 1:1.
2) Приготовление суспензии тест-культуры.
Используют ацетоновый порошок убитой культуры Мусгососсus 1уsоdеiсticus, который вносят в 1/5 М фосфатный буфер с рН 6,2 до конечной оптической плотности 0,65-0,70, которая не изменяется при комнатной температуре в течение 30 мин.
К 1 мл суспензии тест-культуры добавляют 1 мл разведенной физиологическим раствором сыворотки молока, быстро перемешивают и измеряют оптическую плотность Д
0
на спектрофото- метре при длине волны 540 нм в кювете с рабочей длиной 1 см. Затем пробирки ставят в термостат при температуре 37°С на 30 мин, после чего снова определяют оптическую плотность (Д
30
).
Активность лизоцима выражают в условных единицах активности (УЕА) и определяют по формуле:
Д
0
-Д
30
УЕД
= ——————,
30 где Д
0
- начальная оптическая плотность образца;
Д
30
- оптическая плотность через 30 мин;
30 - время инкубации образца в термостате, мин.
1 УЕА - изменение оптической плотности на 1 единицу за 1 мин одним мл сыворотки мо- лока.
По данным Н.А. Сапожниковой (1992), в молоке клинически здоровых коров активность мурамидазы составляет 0,56±0,02 УЕ, а больных субклиническим маститом - 0,46±0,01 УЕ. в) Метод П. А. Емельяненко и др.
1) Приготовление агаровых пластинок.
1% раствор агара «Дифко» на 1/15 М фосфатном буфере расплавляют 15-20 мин на кипя- щей водяной бане. В охлажденный до 60-70°С раствор вносят ацетоновый порошок тест-микроба
Мусгососсus 1уsоdеiсticus из расчета 20 мг на 100 мл среды и перемешивают до получения одно- родной смеси. Смесь разливают в прямоугольные кюветы из органического стекла размером
30х17х1,5 см так, чтобы получился слой агара толщиной 4 см. После застывания в агаре с помо- щью тонкостенной металлической трубочки с наружным диаметром 5мм делают луночки на расстоянии 1,5 см друг от друга.
2) Приготовление обезжиренного молока.
Пробу молока (2-5 мл) выдерживают в холодильнике при температуре 4-6°С в течение 12-
14 ч и снимают верхний слой с жиром.
3) Приготовление растворов лизоцима.
Стандартный лизоцим разводят в 1/15 М фосфатном буфере до концентрации1, 3, 5, 10,
20, 40 и 70 мкг/мл.
Растворы стандартного лизоцима и пробы молока вносят в луночки агаровой пластинки в количестве по 0,05 мл. Кюветы с образцами выдерживают 48 ч во влажной камере при комнатной температуре 22-24°С и линейкой измеряют диаметры зон лизиса.
Обработка результатов:
По данным зон лизиса растворами стандартного лизоцима строят калибровочную кривую в полулогарифмическом масштабе и с ее помощью определяют концентрацию лизоцима в иссле- дуемых пробах молока. г) Метод Оссермана в модификации Фараджи

162
Подготовка к анализу:
1) Приготовление агаровых пластинок.
1% раствор агара «Дифко» на 1/15 М фосфатном буфере рН 6,2 расплавляют 15-20 мин на водяной бане. В охлажденный до 6070°С раствор вносят ацетоновый порошок тест-культуры
Мусгососсus 1уsоdеiсticus из расчета 50 мг на 100 мл среды и перемешивают до получения одно- родной смеси. Смесь разливают в чашки Петри так, чтобы получился слой агара толщиной 4мм

1   ...   27   28   29   30   31   32   33   34   35