149 зеина). При этом происходит более полное осаждение казеина. Реакцию молока проверяют потенциометром или универсальным индикатором. Выпавший оса- док отделяют фильтрованием. Казеин отделяют в день взятия пробы молока, так как при хранении в холодильнике в течение 1-2 суток изменяется соотношение фракций белка.
4) Молочную сыворотку используют для электрофоретического анализа. Перед проведением электрофореза кюветы камеры заполняют буфером, доводя до оди- накового уровня. Электроды полностью помещают в буферный раствор.
5) Для электрофореза используют хроматографическую фильтровальную бумагу № 4, выпускаемую Санкт-Петербургской фабрикойим. Володарского. Полоску бу- маги размером 3х40 см или 4х32 см помещают в камеру за 1-1,5 ч до нанесения сыворотки для увлажнения.
6) Сыворотку молока в количестве 0,08 мл наносят дробно в 4 приема на полоску, отступя от катодного конца 10см.
7) Электрофорез проводят в следующем режиме: напряжение 300 В, сила тока - 0,3 мА/см, градиент потенциала - 5 В/см, время - 6 ч.
8) По окончании электрофореза прибор выключают. Электрофореграммы сушат при 100°С 10 мин в горизонтальной плоскости.
9) Окрашивают раствором кислотного сине-черного или бромфенолового синего в течение 15 мин.
10) Для удаления красителя, с безбелковых участков электрофореграммы промыва- ют от кислотного сине-черного красителя 10% раствором уксусной кислоты с перегнанным фенолом;бромфенолового синего – 5% раствором уксусной кисло- ты.
11) Для установки соотношений белковых фракций сыворотки молока электрофоре- грамму разрезают на отдельные выявленные фракции. Кусочек бумаги, соответствующий каждой фракции, измельчают, помещают в пробирку с 5-10 мл 0,1н едкого натра и элюируют в течение 1 ч. Для элюирования бета-лактоглобулиновой фракции берут вдвое больший объ- ем 0,1н едкого натра. Оптическую плотность раствора красителя в элюиате измеряют на ФЭ-
Ке при красном светофильтре (длина волны 630 нм). Контролем служит эталон элюиата из участка электрофореграммы, не содержащего белка.
Обработка результатов:
Процентное содержание каждой фракции белка вычисляютпо соотношению между пока- зателями оптической плотности данной фракции и суммы показателей оптической плотности всех фракций, которую принимают за 100, с учетом двукратного увеличения показателя для фракции бета-лактогобулинов.
На стартовой линии выявляют неидентифицированную фракцию в виде одной иди двух полос (неподвижная фракция). Неподвижную фракцию выделяют в самостоятельную, так как она закономерно выявляется на всех электрофореграммах.
Пример. Показания ФЭК для сывороточного альбумина составляют 0,07, бета- лактоглобулина - 0,238 х 2 = 0,476, альфа-лактоглобулина - 0,196, иммунных глобулинов - 0,262 и неподвижной фракции -0,096. Сумма показателей оптической плотности - 1,100, а процентное соотношение фракций белка соответственно: сывороточный альбумин - 0,070 - 6,4% бета-лактоглобулин - 0,476 - 43, 3% альфа-лактоглобулин - 0,196 - 17,8% иммунные глобулины - 0,292 - 23,8% неподвижная фракция - 0,096 - 8,7%
1,100 - 100%
В сыворотке молока больных маститом коров увеличивается содержание сывороточного альбумина и иммунных глобулинов по сравнению со здоровыми животными.
Определение лактозы
Лактоза (молочный сахар) образуется в молочной железе и ее количество изменяется в за- висимости от функционального состояния органа, что используется при оценке качества молока и диагностике патологических процессов в молочнойжелезе.
Используют датский электронный прибор «Милко-Скан 203». В молоке здоровых коров количество лактозы составляет 4,6-4,9%, в молозиве - 3,0-4,I%. При воспалительном процессе в молочной железе количество лактозы снижается.
Определение концентрации водородных ионов (рН).
Изменение рН молока происходит как при физиологической перестройке функции молоч- ной железы (различные сроки лактации, период сухостоя), так и при патологических процессах,
150 протекающих в этом органе. Повышение щелочности (рН больше 6,8) является ориентирующим признаком при постановке диагноза на мастит.
Концентрацию водородных ионов (рН) определяют с помощью приборов - рН метров и различных индикаторов. а) Определение рН-метром
Используют рН-метр-милли-вольтметр ЛПМ-60 М, рН-метр-милли-вольтметр рН-340, рН- метр для молока и молочных продуктов рН 222,1 и др.
В стаканчик наливают 2/3 объема исследуемого молока, опускают в него измерительные электроды и по отклонению стрелки милливольтметра устанавливают по шкале величину рН. б) Проба с бромтимоловым синим
Приготовление раствора бромтимолблау:
0,5 г бромтимолблау растворяют в 50 мл этилового спирта и добавляют 50 мл дистиллиро- ванной воды.
Проведение анализа:
1) Проба на стекле. На поверхность предметного стекла наносят 1 каплю исследуемого молока и добавляют 1 каплю раствора бромтимолового синего. Учитывают цвет смеси.
2) Проба на молочно-контрольной пластинке. В луночки ПМК-1, ПМК-2, УОКМ-1 (уст- ройство для определения качества молока) из соответствующих долей вымени надаивают по 1 мл молока и добавляют по 1-2 капли раствора бромтимолового синего. Учитывают цвет молока на месте контакта с индикатором.
Оценка результатов: желтый, желто-зеленый - рН молока 6,3-6,8; беловато-желтый, белый - рН молока меньше 6,3; зеленый, синий - рН молока щелочная, больше 6,8.
Определение кислотности по Тернеру.
Кислотность является в основном показателем свежести и степени загрязненности моло- ка. В конце лактации и при воспалении молочной железы кислотность молока (секрета) снижает- ся.
Проведение анализа:
В коническую колбу вносят 10 мл исследуемого молока, 20млдистиллированной воды и 3 капли I% спиртового раствора фенолфталеина, перемешивают и титруют из бюретки 0,1н раство- ром едкого натра (или кали) до появления не исчезающего в течение 30 с. слабо-розового окраши- вания.
Обработка результатов:
Расчет ведут по формуле
Х = А х 10, где х - количество молока в градусах Тернера;
А - количество мл 0,1н раствора едкого натра (или калия),пошедшего на титрование 10 мл молока;
10 - коэффициент пересчета в градусы Тернера (количествомл 0,1н раствора едкого натра или калия, пошедшего на титрование 100 мл молока).
Кислотность свежего молока от здоровых коров составляет в среднем 16-19°Т, молозива первого удоя - 45-55°Т, седьмого дня -19.5°Т.
Определение кетоновых (ацетоновых) тел реактивом Лестраде. Кетоновые (ацетоно- вые) тела состоят из ацетона, ацетоуксусной кислоты, которые являются промежуточными про- дуктами обмена веществ в организме и могут увеличиваться при его нарушении не только в крови, моче, но и в молоке. Проводят определение как общего количества кетоновых тел, так и раздель- но.
Приготовление реактива Лестраде:
1 г натрия нитропрусида, 20 г натрия углекислого безводного и 20 г аммония сульфата смешивают и растирают в ступке до получения мелкого однородного порошка.
Хранят в темной посуде с плотно притертой пробкой.
Проведение анализа:
На фильтровальную бумагу наносят 0,2 г реактива Лестраде и смачивают его 2-3 каплями исследуемого молока. Через 40-60 с учитывают цвет смеси.
Оценка результатов:
В молоке (молозиве) здоровых коров сумма кетоновых тел (бета-оксимасляная, ацетоук- сусная кислоты, ацетон) составляетне более 8 мг%.
Окраска смеси молока с реактивом Лестраде в сиреневый цвет свидетельствует о наличии в молоке (молозиве) более 10% кетоновых тел.
Определение пигментов крови
151
В молоке здоровых животных встречаются лишь единичные эритроциты. Увеличение их количества может быть следствием ушибов, травм, воспалительных процессов молочной железы, а также послеродового отека вымени, особенно у первотелок.
Химические пробы по обнаружению пигментов крови основаны на гемолизе эритроцитов и освобождении гемоглобина, который способен отнимать водород от гвояковой смолы, бензиди- на, пирамидона и других органических соединений и переносить его на перекись водорода с образованием окрашенных соединений. а) Проба с гвояковой смолой
Приготовление раствора гвояковой смолы.
5 г смолы растворяют в 95 мл 90% этилового спирта.
Проведение анализа:
Готовят смесь 5% спиртового раствора гвояковой смолы (1 мл) с перекисью водорода (0,5 мл), которую осторожно наслаивают на исследуемое молоко, предварительно налитое в пробирку объемом 5 мл.
Оценка результатов:
При содержании в молоке гноя или пигментов крови на границе соприкосновения жидко- сти через 2-3 мин образуется синее или темно-синее кольцо. При встряхивании вся жидкость окрашивается в темно-синий цвет.
Б)Пробасбензидином
Проведение анализа:
К смеси из 5 мл 3% раствора перекиси водорода добавляют 2 мл насыщенного раствора бензидина в ледяной уксусной кислоте. Смесь тщательно взбалтывают и прибавляют в нее 2-10 капель исследуемого молока.
Оценка результатов:
При наличии в молоке гноя или пигментов крови жидкость окрашивается сначала в зеле- ный цвет, а через 0,5-1 мин - в темно-синий.
При отрицательной реакции жидкость будет светлая с беловатым хлопьевидным осадком. в) Проба с пирамидоном
Проведение анализа:
В пробирку с 5 мл молока прибавляют 1 мл 50%-ного раствора уксусной кислоты, взбал- тывают и добавляют 0,5 мл 5%-ного спиртового раствора пирамидона, 6-8 капель перекиси водо- рода.
Оценка результатов:
При положительной реакции жидкость окрашивается в светло-фиолетовый (аметистовый) цвет, что указывает на наличие пигментов крови.
Определение жира.
Жир молока является продуктом синтеза альвеолярного эпителия, и его количество опре- деляется функциональной активностью секреторных клеток. К концу лактации и при воспалении молочной железы количество жира в молоке (секрете) снижается.
1)Стандартный сернокислый способ
Способ основан на свойстве белков молока растворяться в серной кислоте, освобождения жира и образования амилово-серного эфира в присутствии изоамилового спирта.
Проведение анализа:
В молочный жирометр (бутирометр) наливают с помощью пипетки автомата 10 мл серной кислоты плотностью 1,81-1,82 (при 20°С), затем пипеткой медленно приливают 10,77 мл молока и
1 мл изоамилового спирта (плотность при 20° С - 0,811-0,812). При этом избегают смачивания горлышка жиромера. Жиромер плотно закрывают резиновой пробкой и встряхивают до полного растворения белка, на что указывает отсутствие белых крупинок. При встряхивании применяют меры предосторожности или специальные штативы.
После полного растворения белка жиромер ставят пробкой вниз в водяную баню при тем- пературе 65° С на 5мин
1 ... 27 28 29 30 31 32 33 34 35
, затем центрифугируют 5 мин со скоростью не менее 1000 об/мин. После центрифугирования движением резиновой пробки регулируют столбик жира в жиромере так, чтобы он находился в трубке со шкалой, и снова помещают в водяную баню при температуре 65±2°С на 5 мин, затем жиромер вынимают из водяной бани и быстро производят определение жира. Учет результатов: Для определения количества жира жиромер держат вертикально, так, чтобы граница жира находилась на уровне глаз, и движением пробки вверх или вниз устанавливают нижнюю границу столбика жира на целом делении шкалы. От него отсчитывают число делений до нижней точки мениска столбика жира в процентах (каждое малое деление соответствует 0,I% жира, большое – I% жира).
152
Граница раздела жира и кислоты должна быть резкой, а столбик жира прозрачным. При невыполнении этих условий анализ проводят повторно.
2) Определение общих липидов с сульфофосфованиловым реактивом
Продукты распада ненасыщенных липидов образуют с реактивом состоящим из серной, ортофосфорной кислот и ванилина, окрашенное соединение. Интенсивность окраски пропорцио- нальна содержанию общих липидов в молоке.
Реактивы:
-Серная кислота концентрированная.
-85% фосфорная или ортофосфорная кислота.
-0,6% раствор ванилина. 0,6 г ванилина растворяют в небольшом количестве дистилли- рованной воды, нагревая на водяной бане.
После охлаждения объем доводят до 100 мл, хранят при комнатной температуре.
-Фосфорнованилиновая смесь. К 4 частям фосфорной кислоты (орто) добавляют 1 часть
0,6% раствора ванилина. Хранят в посуде из темного стекла при комнатной температуре.
-Хлороформ для наркоза.
-Стандартный раствор триолеина. 500 мг триолеина вносят в мерную колбу на 100 мл и до метки доливают хлороформом. Тщательно перемешивают. Хранят в холодильнике, в посуде из темного стекла с притертой пробкой.
-Спирт этиловый абсолютный.
-Спирт метиловый.
Оборудование и аппаратура:
1) Фотоэлектроколориметр.
2) Водяная баня.
3) Весы аналитические.
4)Холодильник бытовой.
Проведение анализа:
В пробирку вносят 0,05 мл молока и 5 мл концентрированной серной кислоты. Тщательно перемешивают, предварительно закрыв пробирку пробкой, обернутой алюминиевой фольгой.
Пробирку помещают в кипящую водяную баню на 10 мин, затем охлаждают под струѐй водопро- водной воды.
В чистую пробирку вносят 0,4 мл смеси, добавляют б мл фос-форнованилиновой смеси, тщательно перемешивают и оставляют на 45 мин в темноте при комнатной температуре. После этого фотометрируют на ФЭКе при длине воины 500-560 нм (зеленый светофильтр № 6) в кювете с рабочей длиной 1 см против контроля (вместо молока берут 0,05 мл дистиллированной воды и обрабатывают также, как и молоко).
Одновременно обрабатывают 0,1 мл стандартного раствора триолеина, как и опытную пробу.
Обработка результатов:
Расчет проводят по формуле
Еоп
Х = ——————— х 500 Х 2,
Ест где Х - количество общих липидов, мг%;
Еоп - экстинция опытной пробы;
Ест - экстинция стандартного образца;
500 - концентрация липидов в стандарте, мг%
2 - фактор разведения;
Посуду необходимо мыть отдельно от другой. Пробирки и пипетки перед исследованием прополаскивают дистиллированной водой, а затем - этиловым и метиловым спиртом.
В молоке здоровых коров содержание жира колеблется в пределах 3,4-4,2%, в молозиве -
4,5-5,2%
Бактериологическое исследование секрета молчной железы
Бактериологическое исследование молока проводится для определения общей бактериаль- ной загрязненности, выявления микроорганизмов, вызвавших заболевание молочной железы, определения чувствительности их к антимикробным препаратам, оценки результатов лечения больных животных
153
Правила отбора проб молока (секрета)
Молоко (секрет) для бактериологического исследования отбирают в стерильные пробирки из долей вымени с соблюдением правил асептики. Для этого перед взятием пробы соски вымени и руки исследователя протирают ватным тампоном, смоченным 70° этиловым или денатурирован- ным спиртом, и надаивают в пробирки 5-10 мл альвеолярного молока (в конце дойки). При взятии пробы следят за тем, чтобы сосок не касался края пробирки. При повторном взятии пробы с целью подтверждения диагноза на мастит может быть использовано как цистернальное, так альвеолярное молоко. Пробирку с молоком (секретом) закрывают стерильной ватно-марлевой или резиновой пробкой и на этикетке записывают кличку или инвентарный номер коровы, долю вымени и ее состояние (здоровая, больная).
Правила доставки
Пробы молока после их отбора с сопроводительным документом доставляют в лаборато- рию в течение 3-4 ч с момента взятия в специальных емкостях, обеспечивающих температуру не выше 8-10°С, или в термосах со льдом.
Проведение исследований
Бактериологическое исследование молока (секрета) проводят сразу после доставки его в лабораторию. Оставшееся молоко хранят при температуре не выше 6°С.
Посев молока (секрета) проводят на мясо-пептонный агар с цитратной кровью крупного рогатого скота или дефибринированной кровью барана (рецепт 1) и дифференциально- диагностические или элективные среды.
Для идентификации выросших культур микроорганизмов учитывают характер роста коло- ний и вид гемолиза на кровяном МПА, проводят микроскопию мазков, сделанных из одинаковых по морфологическим свойствам колоний и окрашенных по Грамму, изучают культурально-би- охимические свойства. а) Выделение золотистого стафилококка
Рост на кровяном МПА. Колонии средние и крупные, выпуклые с гладкой или шерохова- той поверхностью, ровными краями, золотистого цвета.
Образуют зону гемолиза.
α-гемолиз - зона прозрачная вокруг колонии; β-гемолиз - зона непрозрачная (матовая.), лучше проявляется при выдержке посевов в холодильнике при температуре 5-8°С в течение 24 ч;
α и β гемолиз смешанный.
При микроскопии имеют шарообразную форму и располагаются в виде гроздевидных скоплений, тетрами или одиночно. По Грамму красятся положительно.
ДНК-азная активность. Выделение золотистого стафилококка ускоренным методом и определение ДНК-азной активности проводят с использованием элективной, дифференциально- диагностической среды ДНК-новокаинового агара (рецепт 2).
Элективные свойства среды обусловлены ингибирующим действием на постороннюю микрофлору новокаина, дифференцирующие - наличием ДНК, позволяющей идентифицировать золотистый стафилококк по его дезоксирибонуклеазной активности.
Готовят разведение исследуемых проб молока, (секрета) на стерильном физиологическом растворе 1:10 и 1:100. В чашку Петри с ДНК-новокаиновым агаром вносят 0,1 мл молока (секре- та) в разведении 1:100 и равномерно распределяют стерильным стеклянным шпателем по всей поверхности питательной среды. Засеянные чашки помещают в термостат крышками вниз и инкубируют при 37-38°С в течение 22-24 ч. Для выделения ДНК-азной активности золотистого стафилококка поверхность среды в чашках с выросшими культурами заливают 5-7 мл 1н раствора соляной кислоты. Чашки с кислотой выдерживают 2-3 мин, затем кислоту сливают и учитывают результаты, просматривая чашки в проходящем свете.
При выделении культуры стафилококка на кровяном агаре и наличии изолированной чис- той культуры ДНК-азная активность может быть определена путем посева на ДНК-агар (рецепт
3).
На ДНК-новокаиновом агаре золотистый, стафилококк растет в виде крупных круглых колоний с ровными краями, окруженных зоной просветления с четкими границами.
Для определения количества золотистого стафилококка в 1 мл исследуемого молока (сек- рета) подсчитывают колонии с зоной просветления по всей поверхности среды и полученное число колоний умножают на 10 (брали 0,1 мл материала) и на 100 (степень разведения).
Каталазная активность. На предметное стекло наносят каплю 10% перекиси водорода и в ней растирают внесенную бактериологической петлей чистую культуру микроорганизмов.
При положительной реакции на каталазу происходит интенсивное газообразование кото- рое проявляется вспениванием капли перекиси водорода. Фермент каталазу содержат стафило- кокки и микрококки.