Исследование особенностей влияния TGFв2 на показатели апоптоза децидуальных мононуклеарных клеток показало, что в группе без гестоза фактор роста не вызывал существенных изменений показателей раннего и позднего апоптоза лимфоцитов (р>0,05 в обоих случаях по сравнению с показателями 24-часового контроля), но угнетал переход макрофагов в необратимый апоптоз (p<0,05). Стимуляция клеток препаратом TGFв2 в группе с гестозом приводила к достоверному повышению уровня апоптирующих лимфоцитов, вызывая усиление, как ранних, так и необратимых этапов их апоптоза (p<0,01 в обоих случаях по сравнению с показателями 24-часового контроля). Действие TGFв2 на апоптоз децидуальных макрофагов при гестозе было аналогичным в контрольной группе и определялось снижением уровня апоптирующих децидуальных макрофагов, в результате угнетения содержания клеток, находящихся на поздних этапах апоптоза (p<0,05 в обоих случаях по сравнению с показателями 24-часового контроля).
По данным RT-PCR при неосложненной гестозом беременности и при гестозе TGFв2 не влиял на экспрессию мРНК APAF лимфоцитами и макрофагами децидуальной оболочки (p>0,05 во всех случаях по сравнению с показателями 24-часового контроля), но усиливал синтез XIAP в обеих клеточных популяциях (p<0,05 во всех случаях по сравнению с показателями 24-часового контроля).
Вероятно, неоднозначность воздействия TGFв2 на апоптоз децидуальных лимфоцитов и макрофагов определяется особенностями экспрессии его рецепторов в различных клеточных пулах и исходным характером процессов инициации их апоптоза в норме и при патологии. Отсутствие значимых изменений в регуляции раннего и позднего апоптоза децидуальных мононуклеарных клеток при воздействии TGFв2 в группе без гестоза могло быть обусловлено низким уровнем экспрессии его рецепторов, а изменения в группе с гестозом - усилением экспрессии рецепторов к TGFв. Косвенным подтверждением высказанного нами предположения могут служить полученные данные об усилении продукции TGFв2 в децидуальной оболочке при легкой и тяжелой степени гестоза, свидетельствующие о высокой значимости данного фактора роста в процессах иммунорегуляции на локальном уровне при гестозе. Возможно, при гестозе TGFв2 усиливал лишь рецептор-опосредованный путь апоптоза децидуальных лимфоцитов, так какпоказано, что TGFв влияет именно на рецепторный путь апоптоза в различных клетках, индуцируя экспрессию Fas и активацию каспазы-8 [Freathy I. et al., 2000; Cain R. et al.,2001; Kim S.G., 2004]. При этом стимулированный фактором роста синтез XIAP не был достаточным для блокирования данного процесса. Изменения параметров апоптоза децидуальных макрофагов при воздействии TGFв2 при гестозе были иными, чем в популяции децидуальных лимфоцитов. Возможно, для них индукция синтеза антиапоптотических факторов, таких как XIAP, при воздействии TGFв2 была более значимой.
Изменения при гестозе параметров апоптоза лимфоцитов и макрофагов ворсинчатого хориона были минимальными. Для обеих клеточных популяций при гестозе было характерным небольшое повышение содержания клеток, находящихся на поздних этапах апоптоза (p<0,05 в популяции лимфоцитов и p>0,05 в популяции макрофагов, по сравнению с показателями контрольной группы). Характер экспрессии APAF лимфоцитами и макрофагами ворсинчатого хориона не различался в сравниваемых группах, но при гестозе было выявлено снижение синтеза XIAP лимфоцитами (p<0,05). Выявленные нами изменения могли отражать развитие компенсаторных реакций, подавляющих патологическое воздействие активированных иммунных клеток в системной циркуляции плода. По данным литературы снижение готовности к апоптозу пуповинных ЦТЛ и 56+ ЕК, уменьшение уровня апоптирующих лимфоцитов, усиление экспрессии FasL на поверхности ЦТЛ и ЕК является одним из патогенетических механизмов поражения ЦНС плода [Серкина Е.В., 2008]. Кроме того, именно в ворсинчатом хорионе по данным иммуногистохимического исследования при гестозе отмечалось усиление продукции bcl-2 в синцитиотрофобласте, что можно также рассматривать как компенсаторную реакцию, способствующую сохранению структуры хориона в окружении повреждающих факторов. Нарушение этих компенсаторных реакций могло определять максимальную выраженность апоптотических процессов в цитотрофобласте базальной децидуальной пластинке, в ворсинчатом хорионе и межворсинчатом пространстве при тяжелых формах гестоза.
Результаты эксперимента показали, что на уровне ворсинчатого хориона TGFв2 вызывал однотипные апоптоз-регулирующие реакции при неосложненной гестозом беременности и при гестозе. В обеих исследуемых группах усиливался AnnexinV+ лимфоцитов под воздействием TGFв2 (p<0,05 в контрольной группе и p<0,001 в группе с гестозом по сравнению с показателями 24-часового контроля). Но в группе без гестоза рост апоптирующих лимфоцитов определялся стимуляцией ранних этапов апоптоза (p<0,01 по сравнению с показателями 24-часового контроля), а в группе с гестозом его поздних этапов (p<0,001 по сравнению с показателями 24-часового контроля). Стимуляция TGFв2 не вызывала достоверных изменений в показателях раннего и позднего апоптоза макрофагов ворсинчатого хориона в обеих исследуемых группах (p>0,05 во всех случаях по сравнению с показателями 24-часового контроля).
В ворсинчатом хорионе TGFв2 не вызывал изменений в экспрессии мРНК анализируемых апоптоз-регулирующих генов лимфоцитами и макрофагами при неосложненной гестозом беременности и лимфоцитами в группе с гестозом (p>0,05 по сравнению с показателями 24-часового контроля во всех случаях). Усиление экспрессии мРНК XIAP макрофагами при воздействии фактора роста отмечалось только в группе с гестозом (p<0,05 по сравнению с показателями 24-часового контроля). Вероятно апоптоз-регулирующее влияние TGFв2 на иммунные клетки плодового происхождения, также как и на клетки периферической крови матери в большей степени затрагивает рецептор-опосредованный путь апоптоза.
Таким образом, развитие гестоза ассоциируется с изменением апоптоза клеток иммунной системы и тканей плаценты. Дисбаланс продукции апоптоз-регулирующих факторов с усилением влияния проапоптотического белка р53 по-видимому лежит в основе усиление апоптоза в плаценте при гестозе, что приводит к повреждению фетоплацентарного барьера и усиленному поступлению в кровоток матери микрочастиц трофобласта и клеток плодового происхождения. Повышенная антигенная стимуляция материнской иммунной системы в свою очередь может инициировать цитотоксические и аутоиммунные реакции, обусловливая полиорганную недостаточность при гестозе и повреждение тканей плаценты, что формирует порочный круг патологических реакций. Нарушение эндо- и экзогенной регуляции иммунного апоптоза на генном и молекулярном уровнях, приводящее к накоплению активированных цитотоксических лимфоцитов и моноцитов/макрофагов, вероятно, способствует развитию этих реакций.
Определение уровня содержания в плаценте экспрессии р53 и bcl-2 у беременных женщин с гестозом позволяет проводить дифференциальную диагностику степени тяжести гестоза.
Выводы
Установлено, что гестоз чаще возникает у женщин, страдающих экстрагенитальной патологией (артериальная гипертензия, ВСД по гипертоническому типу, хронический пиелонефрит, ожирение, диффузное увеличение щитовидной железы, хронический тонзиллит); беременность у которых чаще осложняется угрозой прерывания, фетоплацентарной недостаточностью, преждевременными родами, возникновением перинатальной патологии у новорожденных (СЗРП, перинатальное поражение ЦНС, инфекционно-воспалительные заболевания) и перинатальных потерь.
У женщин с гестозом увеличивается количество лимфоцитов периферической крови, лимфоцитов и макрофагов децидуальной оболочки, находящихся на обратимых этапах апоптоза, и лимфоцитов ворсинчатого хориона на необратимых этапах апоптоза, при гестозе легкой степени повышается содержание периферических лимфоцитов, находящихся на необратимых этапах апоптоза.
Для женщин с гестозом характерно снижение уровня экспрессии мРНК XIAP периферическими и трофобластическими лимфоцитами и усиление синтеза APAF лимфоцитами и макрофагами децидуальной оболочки.
При гестозе легкой степени уровень TGFв2 снижается в периферической крови и повышается в децидуальной оболочке плаценты.
В эксперименте in vitro при гестозе TGFв2 усиливает апоптоз децидуальных лимфоцитов и экспрессию мРНК XIAP макрофагами ворсинчатого хориона; при беременности независимо от наличия гестоза - усиливает апоптоз лимфоцитов и моноцитов периферической крови, лимфоцитов ворсинчатого хориона, но угнетает апоптоз децидуальных макрофагов и стимулирует синтез XIAP иммунокомпетентными клетками децидуальной оболочки плаценты.
При гестозе нарушается продукция факторов, регулирующих апоптоз: усиливается экспрессия молекул р53 в цитотрофобластических клетках базальной децидуальной оболочки и ворсинчатого хориона, и повышается экспрессия молекул bcl-2 в синцитиотрофобластических клетках ворсинчатого хориона, выраженность этих изменений нарастает с утяжелением степени гестоза.
1.В группу риска на развитие гестоза следует относить женщин с экстрагенитальной патологией (артериальная гипертензия, ВСД по гипертоническому типу, хронический пиелонефрит, ожирение, диффузное увеличение щитовидной железы, хронический тонзиллит).
2. Для уточнения степени тяжести гестоза целесообразно проводить иммуногистохимическое исследование плаценты, полученной после родов от женщин с гестозом, с определением индекса экспрессии маркеров апоптоза p53 и bcl-2. При значении p53 равном или более 2,4 у.е. и bcl-2 равном или более 2,2 у.е. диагностируют гестоз тяжелой степени, а при значении p53 2,0-2,39 у.е. и bcl-2 1,8-2,19 у.е. диагностируют гестоз легкой степени тяжести.
Список работ, опубликованных по теме диссертации
Публикации в журналах, включённых в перечень изданий, рекомендованных ВАК РФ:
1.Кудряшова А.В., Сотникова Н.Ю., Мальгина Л.Ю., Панова И.А. Влияние трансформирующего фактора роста бета-2 на показатели апоптоза децидуальных лимфоцитов и макрофагов // Аллергология и иммунология. -2009.- т.10, №2.- С.170-171.
2.Кудряшова А.В., Сотникова Н.Ю., Панова И.А., Мальгина Л.Ю., Мамалыга И.Н. Нарушение регуляции апоптоза лимфоцитов при гестозе // Медицинская иммунология.- 2009.- Т.11.- № 4-5.- С.411.
3.Кудряшова А.В., Мальгина Л.Ю. Характер экспрессии апоптоз-регулирующихгенов лимфоцитов и моноцитов/макрофагов периферической крови, децидуальной оболочки плаценты и тканях ворсинчатого хориона при гестозе // Вестник Уральской Медицинской Академической науки (Тематический выпуск по аллергологии и иммунологии). - 2010. - №2/1(29) С.156.
Публикации в журналах, сборниках, материалах конференций и тезисы докладов:
1. Kudryashova A.V., Sotnikova N.Yu., Malgina L.Yu., Panova I.A. The influence of the transforming growth factor beta (TGF-в2) upon the parameters of apoptosis of decidual lymphocytes and macrophages // New horizons in allergy, asthma and immunology / Ed. R. Sepiashvili.- Bologna, Italy.: MEDIMOND- 2009.- P.173-177.
2.Мальгина Л.Ю., Кудряшова А.В., Панова И.А. Параметры апоптоза периферических лимфоцитов при гестозе и возможности их регуляции трансформирующим фактором роста-бета2. // Вестник Российской военно-медицинской академии (Приложение). -2009. - Ч.II.- №1(25).- С.499.
3.Сарыева О.П., Мальгина Л.Ю., Панова И.А. Клинико-морфологическая характеристика плацент при различных степенях тяжести гестоза // Вестник Российской военно-медицинской академии (Приложение). - 2009. - Ч.I.- №1(25).- С.187.
4.Кудряшова А.В., Панова И.А., Мальгина Л.Ю. Дозовая зависимость регуляции этапов апоптоза периферических лимфоцитов трансформирующим фактором роста - бета2 при физиологической беременности и гестозе // Материалы IV съезда акушеров-гинекологов России.- Москва.- 2008.- С.135-136.
5.Мальгина Л.Ю., Сарыева О.П. Морфологические изменения в плацентах при гестозе различной степени тяжести // Материалы 89-й ежегодной научно-практической конференции студентов и молодых ученых ИвГМА «Неделя науки-2009».- Иваново: 2009.- С.29.
6.Сарыева О.П., Мальгина Л.Ю., Перетятко Л.П., Панова И.А. Особенности воспаления в плаценте при беременности, осложненной гестозом различной степени тяжести // Материалы III Регионального научного форума «Мать и дитя» - М., 2009.- С.245-246.
7.Кудряшова А.В., Сотникова Н.Ю., Панова И.А., Мальгина Л.Ю. Регуляция апоптоза децидуальных лимфоцитов и макрофагов трансформирующим фактором роста бета-2 // Сборник научных трудов и метериалов республиканской научно-практической «Современные перинатальные медицинские технологии в решении проблем демографической безопасности» - Минск.-2009.- С. 143-147.
8. Мальгина Л.Ю., Кудряшова А.В., Панова И.А. Механизмы регуляции апоптоза клеток иммунной системы при неосложненной беременности и гестозе // Проблемы репродукции (специальный выпуск по материалам IV международного конгресса по репродуктивной медицине) - Москва.- 2010.- С.93-94.