Автореферат
диссертации на соискание ученой степени кандидата медицинских наук
Участие апоптоза и факторов его регулирующих в патогенезе гестоза
14.01.01 - «Акушерство и гинекология»
Мальгина Любовь
Иваново - 2010
Работа выполнена в Федеральном государственном учреждении «Ивановский научно-исследовательский институт материнства и детства им. В.Н.Городкова Федерального агентства по высокотехнологической помощи»
Научные руководители -
доктор медицинских наук Панова Ирина Александровна
доктор биологических наук Кудряшова Анна Владимировна
Официальные оппоненты:
Доктор медицинских наук, профессор Охапкин Михаил Борисович
(ГОУ ВПО «Ярославская государственная
медицинская академия Росздрава»
Доктор медицинских наук, профессор Макаров Олег Васильевич
(ГОУ ВПО «Российский государственный медицинский университет Росздрава»
Ведущая организация - Государственное образовательное учреждение высшего профессионального образования «Московская медицинская академия им. Сеченова Федерального агентства по здравоохранению и социальному развитию».
Актуальность проблемы
Одним из наиболее тяжелых осложнений беременности является гестоз, который до сих пор, занимает ведущее место в структуре материнской и перинатальной заболеваемости и смертности [Айламазян Э.К. и соавт, 2008, Савельева Г.М. и соавт.,2009]. Одним из важнейших механизмов регуляции гестационного процесса является апоптоз. В процессе гестации апоптоз необходим для децидуализации маточного эндометрия, адекватного ремоделирования тканей материнской децидуальной оболочки, инвазии развивающегося эмбриона, обеспечения иммунной толерантности к беременности, подготовке к родам [Joswig A., et al., 2003; Dai S.Y., et al, 2004; Ashton S.V., et al, 2004]. Нарушение апоптоза на системном и локальном уровнях отмечается при развитии осложнений беременности в том числе и гестоза [Сотникова Н.Ю. и др., 2008; Ishihara N. et.al., 2002; Sun L.Z. et.al.,2003; Austgulen R. et al.,2004]. Однако особенности апоптоза клеток плаценты при гестозе рассматриваются без учета локализации тканей цитотрофобласта в базальной децидуальной пластинке и в ворсинах хориона. Практически не исследованы характеристики апоптоза децидуальных клеток как при неосложненной беременности, так и при гестозе.
В работах ряда авторов было показано, что в плаценте при гестозе возникает дисбаланс в продукции про- и анти-апоптотических факторов [Levy R, 2002; Sun L.Z., et al, 2003; Aban M. et al, 2004; Ishioka S. et al.,2006, 2007]. Но данные, приводимые различными исследователями, не всегда соответствуют друг другу, что не позволяет сделать однозначных выводов о роли апоптоза в патогенезе гестоза.
Большинство исследователей показывают, что при гестозе в периферической крови матери и в плаценте усиливаются процессы активации иммунных клеток, что сопровождается повышением их готовности к апоптозу [Сотникова Н.Ю. и соавт., 2005; Панова И.А., 2007; Посисеева Л.В и соавт.,2008; Darmochwal-Kolarz D.,2002; Borzychowski A.M., 2005; Bachmayer N., 2006; Toldi G., 2008]. Однако характер апоптоза клеток иммунной системы при данной патологии остается практически не изученным. Остаются не исследованными характеристики раннего и завершенного апоптоза лимфоцитов и клеток макрофагального ряда при гестозе, как в периферической крови, так и на уровне плаценты. В литературе отсутствуют данные о характере синтеза клетками иммунной системы апоптоз-регулирующих белков APAF и XIAP при неосложненном течении беременности и при гестозе. Имеются лишь отдельные сведения о том, что изменения в балансе bcl-2 и р53 играют роль в развитии патологии плода и не столь значимы в регуляции апоптоза на системном уровне при гестозе [Веденеева М.В.,2006].
Имеющиеся в литературе данные свидетельствуют о том, что в регуляции апоптоза во время беременности важную роль играет TGF [Liu Z., et al, 2002; Smith S., et al, 2002]. В литературе имеются сведения о том, что TGF может оказывать как негативный, так и позитивный эффект в регуляции программируемой клеточной гибели [Dunker N., et al, 2002; Liu Z. et al., 2002]. Но работы о влиянии TGFв на апоптоз клеток при неосложненной беременности и при гестозе крайне не многочисленны [Chakraborty C, 2002; Lash G. E., 2005], и не исследуют характер апоптоз-регулирующего действия этого фактора на иммунокомпетентные клетки в периферической крови и в плаценте.
Таким образом, изучение характера апоптоза и его регуляции на генном и молекулярном уровнях в иммунных клетках периферической крови, децидуальной оболочки и ворсинчатого хориона, в тканях плаценты при неосложненной гестозом беременности и при гестозе различной степени тяжести представляется несомненно актуальным.
Цель исследования: установить новые патогенетические механизмы развития гестоза у беременных женщин на основании изучения процессов генной регуляции апоптоза периферических и плацентарных лимфоцитов, моноцитов/макрофагов, клеток децидуальной оболочки и ворсинчатого хориона на основании чего разработать критерии дифференциальной диагностики степени тяжести гестоза.
Задачи исследования:
1. Дать комплексную оценку характера течения беременности, родов и состояния здоровья новорожденных у женщин с гестозом.
2. Выявить особенности апоптоза лимфоцитов, моноцитов/макрофагов на системном и локальном уровнях при гестозе и установить характер экспрессии ими мРНК APAF и XIAP.
3. Выявить влияние TGFв2 на экспрессию мРНК проапоптотического белка APAF и антиапоптотического белка XIAP лимфоцитами и моноцитами/макрофагами периферической крови и плаценты при неосложненной беременности и гестозе.
4. Оценить выраженность апоптоза на уровне децидуальной базальной пластинки и ворсинчатого хориона при неосложненной беременности и гестозе.
5. На основании выявленных особенностей экспрессии про- и антиапототических факторов лимфоцитами периферической крови и клетками плаценты разработать критерии дифференциальной диагностики степени тяжести гестоза.
Научная новизна исследования:
Впервые показано, что при гестозе усиливается апоптоз периферических лимфоцитов, децидуальных лимфоцитов и макрофагов, лимфоцитов ворсинчатого хориона.
Впервые выявлено, что при гестозе нарушаются процессы регуляции апоптоза с увеличением экспрессии ингибирующих апоптоз факторов на уровне периферической крови и ворсинчатого хориона и усилением синтеза активирующих апоптоз факторов на уровне децидуальной оболочки.
Впервые установлены особенности влияния TGFв2 на апоптоз иммунокомпетентных клеток при беременности, которые проявляются в стимуляции апоптоза лимфоцитов и моноцитов, в подавлении апоптоза децидуальных макрофагов и в усилении экспрессии XIAP лимфоцитами и макрофагами децидуальной оболочки плаценты.
Впервые установлено увеличение содержания белка р53 в цитотрофобластических клетках базальной децидуальной оболочки, ворсинчатого хориона и уровня bcl-2 в синцитиотрофобластических клетках ворсинчатого хориона с нарастанием степени тяжести гестоза.
Практическая значимость исследования:
Предложен новый способ морфологической диагностики степени тяжести гестоза по определению уровня белков р53 и bcl-2 на уровне децидуальной базальной пластинки и ворсинчатого хориона (положительное решение о выдаче патента от 09.07.2010 по заявке №2009121396 на «Способ морфологической диагностики степени тяжести гестоза»).
Положения, выносимые на защиту:
Гестоз ассоциируется с нарушением процессов апоптоза и дисбалансом синтеза апоптоз-регулирующих факторов APAF и XIAP иммунокомпетентными клетками матери на системном и локальном уровнях, с повышением содержания р53 в клетках цитотрофобласта, и bcl-2 в синцитиотрофобласте, что приводит к нарушению плацентарного барьера, накоплению активированных клонов клеток иммунной системы и развитию цитотоксических и аутоиммунных реакций.
Изменение продукции TGFв2 при гестозе на системном и локальном уровнях ведет к нарушению регуляции апоптоза клеток периферической крови и плаценты. элиминации активированных клонов клеток путем апоптоза.
Определение уровня содержания в плаценте экспрессии р53 и bcl-2 у беременных женщин с гестозом позволяет проводить дифференциальную диагностику степени тяжести гестоза.
Внедрение результатов исследования в практику:
Предложенный способ морфологической диагностики степени тяжести гестоза прошел предрегистрационные испытания в отделение патоморфологии и электронной микроскопии ФГУ «Ив НИИ МиД им.В.Н.Городкова Росмедтехнологий».
Апробация работы: материалы диссертации доложены и обсуждены на конференции по иммунологии репродукции в рамках Объединенного иммунологического форума (Санкт-Петербург, 2008), на II Всемирном форуме по астме и респираторной аллергии (Санкт-Петербург, 2008), на научно-практической конференции «Актуальные вопросы клиники, диагностики и лечения в многопрофильном лечебном учреждении») (Санкт-Петербург, 2009), на XIII Всеросийском научном Форуме с международным участием имени академика В.Н.Иоффе Дни иммунологии (Санкт-Петербург, 2009), на VII съезде иммунологов и аллергологов СНГ (Санкт-Петербург, 2009), на научно-практической конференции «Современные перинатальные медицинские технологии в решении проблем демографической безопасности» (Минск, 2009), на III Региональном научном форуме «Мать и дитя» (Саратов, 2009), на научно-практической конференции молодых ученых, посвященной 75-летию со дня рождения основателя института, В.Н. Городкова (Иваново, 2007), на конференции молодых ученых, памяти В.Н. Городкова (Иваново, 2009).
Публикации: По теме диссертации опубликовано 11 печатных работ, из них 3 в журналах, включённых в перечень изданий, рекомендованных ВАК РФ.
Личное участие автора: автором самостоятельно проводился набор материала по теме диссертации, обследование и лечение тематических больных, выполнена систематизация и компьютерная обработка полученных результатов.
Структура и объем диссертации: диссертация изложена на 190 страницах машинописного текста, содержит введение, обзор литературы, четыре главы собственных исследований, обсуждение результатов, выводы и практические рекомендации. Библиографический указатель включает 115 отечественных и 174 иностранных источников. Работа иллюстрирована 32 таблицами и 24 фотографиями, 8 диаграммами.
Содержание работы
Материалы и методы исследования
Работа выполнена на базе Федерального государственного учреждения «Ивановский научно-исследовательский институт материнства и детства им. В.Н.Городкова Федерального агентства по высокотехнологичной медицинской помощи».
Всего обследовано 150 беременных женщин в III триместре. Среди пациенток были выделены основная группа - 100 женщин с гестозом разной степени тяжести (50 женщин с гестозом легкой и 50 - с гестозом тяжелой степени) и контрольная группа - 50 женщин без признаков гестоза. Степень тяжести гестоза определяли по бальной шкале Гоека в модификации Г.М.Савельевой (1996). Материалом для исследования служили периферическая кровь из локтевой вены, децидуальная ткань и ткань ворсинчатого хориона зрелой плаценты.
Проводилось общеклиническое обследование, в том числе общепринятое лабораторное и биохимическое обследование. Ультразвуковое исследование беременных женщин проводилось на аппарате Aloka SSD-650, кардиотокографическое исследование - на аппарате Analogic Fetalgard -2000.
Иммунологические методы исследования.
Исследование стадий апоптоза производили методом двухцветной проточной цитофлюориметрии на приборе FACScan (Becton Dickinson, США). Для определения количества клеток, вступивших в апоптоз, проводили тест с одновременным окрашиванием клеток Annexin V (CALTAG Laboratories, США) и пропидиумом иодидом (PI) (CALTAG Laboratories, США). Для определения экспрессии в клетках мРНК APAF и XIAP использовали количественный метод RT-PCR в реальном времени. Процедуру выделения тотальной РНК из клеток проводили стандартным гуанидин-тиоцианат-фенол-хлороформ методом с использованием набора реагентов «Онкоскрин» ООО «ГеноТехнология» (Россия). Содержание TGFв2 оценивали методом ELISA на микропланшетном ридере Multiscan EX Labsystems (Финляндия) с использованием тест системы фирмы R&D Systems (США). Стимуляцию периферических мононуклеарных клеток и плацентарных эксплантов осуществляли рекомбинатным TGFв2 (R&D Systems, США) в концентрации 1000 пг/мл в течение 24 часов при 370С и 5% СО2. В качестве контроля использовали клетки и экспланты, инкубировавшиеся в аналогичных условиях в среде RPMI-1640 с 10% FСS.
Морфологические методы исследования. Комплексная оценка структурных изменений последа включала макроскопическое описание, органометрию плацент с определением массы, объема и площади материнской поверхности, световую микроскопию с использованием обзорных элективных методов окраски. Экспрессию апоптоз-регулирующих белков p53 и bcl2 в образцах ткани плаценты определяли методом иммуногистохимии с использованием моноклональных антител и реактивов для иммуногистохимического окрашивания фирмы «Dako» (Германия). Оценка результатов проводилась с учетом иммуногистохимического коэффициента, рассчитываемого по трехбалльной системе.