Статистическая обработка полученных данных проводилась с использованием персонального компьютера с набором стандартных программ в системе Windows XP 2000. Материалы исследования обрабатывались методом вариационной статистики с использованием программы Microsoft Excell из комплекта Microsoft Office 2000.
Результаты исследования и их обсуждение:
Возраст обследованных женщин колебался от 15 до 40 лет. Соматические заболевания в анамнезе, среди которых преобладали детские инфекции и простудные заболевания, имели 100% беременных контрольной группы и 100% беременных основной группы. Женщины во всех исследуемых были сопоставимы по возрасту, перенесенным заболеваниям, по наличию самопроизвольных выкидышей и гинекологических заболеваний в анамнезе. Тяжелый гестоз при предыдущей беременности имели 5% основной группы против 2% в группе контроля. Обращает на себя внимание высокая частота экстрагенитальной патологии, выявленной во время беременности: у 88% женщин основной группы и у 36% контрольной группы (p<0,001). По литературным данным подавляющее большинство соматических заболеваний имеют тенденцию к прогрессированию во время гестационного процесса и, как правило, ухудшают течение беременности и исход родов [Гурьева В.М. и соавт., 2009]. Среди экстрагенитальной патологии в основной группе с гестозом чаще встречались артериальная гипертензия (p<0,001), вегетососудистая дистония по гипертоническому типу (p<0,001), хронический пиелонефрит (p<0,001), ожирение (p<0,001), диффузное увеличение щитовидной железы (p<0,001), хронический тонзиллит (p<0,001). что согласуется с литературными данными о роли экстрагенитальной патологии в развитии гестоза [Шалина Р.И., 2002; Савельева Г.М., 2005, Гурьева В.М. и соавт., 2009].
Изучение характера течения настоящей беременности показало, что осложнения гестационного процесса имели место у 100% обследованных основной группы и 24% контрольной группы (p<0,001). Развитие тяжелых форм гестоза характеризовалось ранним началом, длительным течением и более выраженными клиническими проявлениями [Сидорова И.С., 2004; Савельева Г.М., 2005].
Наиболее неблагоприятными исходами беременности отличается группа с тяжелыми формами гестоза. У женщин этой группы чаще встречались преждевременные роды (в 48,0% случаев), рождение ребенка с перинатальной патологией у 64,7% женщин (СЗРП, перинатальные поражения ЦНС гипоксического и геморрагического генеза, инфекционно- воспалительная патология), что согласуется с современным мнением ведущих ученых [Сидорова И.С., 2004; Савельева Г.М., 2005, Гурьева В.М. и соавт., 2009].
Таким образом наиболее значимыми факторами риска развития гестоза являются: высокая частота экстрагенитальных заболеваний (вегетососудистая дистония по гипертоническому типу, артериальная гипертензия, ожирение, хронический пиелонефрит, хронический тонзиллит, диффузное увеличение щитовидной железы).
С целью уточнения роли иммунных механизмов в патогенезе гестоза мы исследовали изменения апоптоза лимфоцитов и моноцитов/макрофагов, а также механизмов его эндо- и экзогенной регуляции на системном и локальном уровне при беременности неосложненной гестозом и при гестозе.
Независимо от характера инициирующего сигнала к апоптозу, приобретение клеткой способность фиксировать белок AnnexinV свидетельствует о вступлении клетки в состояние апоптоза. Клетки, находящиеся на ранних, обратимых этапах апоптоза, не способны накапливать внутриклеточно PI и имеют фенотип AnnexinV+PI-. В тех случаях, когда апоптоз клеток приобретает необратимый характер, PI свободно поступает в цитоплазму гибнущей клетки, такие клетки приобретают фенотип AnnexinV+PI+.
По нашим данным в периферической крови беременных с гестозом отмечалось повышенное по сравнению с показателями в контрольной группе содержание AnnexinV+ периферических лимфоцитов (20,30±0,94 в контрольной группе; 27,561,49 в группе с легким гестозом, p<0,001; 24,231,47 в группе с тяжелым гестозом, p<0,02), но находящихся на ранних, обратимых, этапах апоптоза (15,780,91 в контрольной группе, 19,640,83 в группе с легким гестозом, p<0,001; 19,220,60 в группе с тяжелым гестозом, p<0,001). Только при гестозе легкой степени было выявлено и повышенное содержание лимфоцитов, находящихся на поздних этапах апоптоза по сравнению с показателями контрольной группы (4,370,67 в контрольной группе, 7,411,09 в группе с легким гестозом, p<0,02). При тяжелом гестозе данный показатель не отличался от такового в группе женщин без гестоза (p>0,05). Нарушение завершенности апоптоза периферических лимфоцитов при тяжелом гестозе может приводить к накоплению активированных ЦТЛ и ЕК, отмечаемому большинством авторов при гестозе [Matthiesen L. et al.,2005; Sharma A. et al., 2007; Панова И.А., 2006; Мамалыга, 2008] и способствовать развитию цитотоксических реакций в различных органах и тканях при гестозе [Панова И.А., 2006; Мамалыга, 2008].
Процесс апоптоза клеток, регулируется различными экзо- и эндогенными сигналами, среди которых важная роль принадлежит проапоптотическому фактору APAF и антиапоптотическому - XIAP [Goyal L., 2001; Holcik M. et al., 2001; Schimmer A.D., 2004; Gupta S. et al., 2005]. Как показали результаты RT-PCR, отмеченное нами при гестозе повышение содержания AnnexinV-позитивных периферических лимфоцитов, не определялось усилением экспрессии мРНК проапоптотического белка APAF, так как во всех исследуемых группах уровень экспрессии мРНК APAF лимфоцитами был крайне незначителен (0,560,56 в контрольной группе, 2,402,40 в группе с легким гестозом; 0,160,16 в группе с тяжелым гестозом; p>0,05 во всех случаях). Известно, что белок APAF играет важную роль в митохондриальном пути апоптоза клеток [Schimmer A.D., 2004; Gupta S. et al., 2005]. Вероятно, митохондриальный путь апоптоза не имеет большой значимости для лимфоцитов периферической крови, как при неосложненной беременности, так и при гестозе. Это согласуется с данными других исследователей, которые показали, что для иммунных клеток периферической крови основным является апоптоз, включаемый рецепторами плазматической мембраны [Самуилов В.Д., 2001]. В тоже время, нами было отмечено достоверное снижение экспрессии периферическими лимфоцитами антиапоптотического белка XIAP при легкой и тяжелой степени гестоза по сравнению с показателями в контрольной группе (5,05±1,75 в контрольной группе, 0,740,22 в группе с легким гестозом, p<0,05; 0,460,06 в группе с тяжелым гестозом, p<0,02). Известно, что XIAP не влияет на индукцию апоптоза, но способен подавлять эффекторные механизмы данного процесса, связывая активные формы каспазы-3, -7 и -9, то есть подавлять переход апоптоза в заключительную фазу деградации клеток [Фильченков А.А., 2003; Schimmer A.D., 2004]. Таким образом, отмеченное нами усиление ранних обратимых этапов апоптоза периферических лимфоцитов при гестозе могло быть обусловлено угнетением синтеза XIAP.
Одним из важнейших экзогенных факторов регуляции апоптоза является TGF, способный осуществлять проапоптотическое действие на уровне каспаз [Cain R et al.,2001; Kim V., 2004; Shooner J., 2005; Kabovashi D. et al., 2005; Konrad М., 2006,]. Результаты наших исследований свидетельствуют о сниженном уровне TGFв2 в периферической крови при гестозе легкой степени тяжести по сравнению с группой контроля (3,43±0,38 в контрольной группе, 2,33±0,36 в группе с легким гестозом, p<0,05), при отсутствии достоверных изменений в сывороточном содержании TGFв2 при тяжелом гестозе (3,35±0,27, p>0,05). гестоз лимфоцит беременность
В эксперименте in vitro TGFв2 вызывал повышение содержания апоптирующих периферических лимфоцитов во всех исследуемых группах, в большей степени стимулируя развитие поздних этапов апоптоза (p<0,001 во всех исследуемых группах). Увеличение уровня погибших лимфоцитов после стимуляции TGFв2 отмечалось только в группах без гестоза и с тяжелым гестозом (p<0,05 по сравнению с 24-часовым контролем в обеих группах). По данным RT-PCR TGFв2 во всех группах не оказывал существенного влияния на показатели экспрессии периферическими лимфоцитами мРНК APAF (p>0,05 по сравнению с 24-часовым контролем во всех группах), но достоверно усиливал синтез XIAP при беременности неосложненной гестозом (p<0,05).
Анализируя характер апоптоза моноцитов, мы установили, что не зависимо от тяжести гестоза отмечалась лишь тенденцию к увеличению периферических моноцитов, вступивших в апоптоз и находящихся на ранних этапах апоптоза, по сравнению с группой контроля (p>0,05 во всех случаях). Уровень периферических моноцитов, находящихся на необратимых этапах апоптоза, оставался неизменным по сравнению с контрольной группой и не зависел от степени гестоза (p>0,05 во всех случаях). Экспрессия мРНК XIAP моноцитами также имела лишь тенденцию к увеличению в обеих исследуемых группах с гестозом (p>0,05 во всех случаях). Во всех исследуемых группах в моноцитах не амплифицировалась мРНК APAF.
Стимуляция препаратом TGFв2 во всех исследуемых группах приводила к переходу моноцитов на необратимые этапы апоптоза (p<0,001 в группе без гестоза; p<0,001 в группе с легким гестозом; p<0,02 в группе с тяжелым гестозом, по сравнению с показателями 24-часового контроля), а в группе с тяжелым гестозом у к увеличению уровня погибших клеток (p<0,02). При этом во всех исследуемых группах TGFв2 не оказывал какого-либо влияния на показатели экспрессии мРНК APAF и XIAP.
Полученные нами данные свидетельствовали о том, что в периферической крови женщин с гестозом, особенно при его тяжелых формах, отмеченное рядом авторов накопление активированных лимфоцитов и моноцитов [Панова И.А., 2008; Мамалыга И.Н., 2009; Darmochwal-Kolarz D. et al., 2002; Dimitracova Dzhambazova E. et al., 2005; Sargent I.L. et al., 2006], может определяться нарушением завершенности апоптоза. Вероятно, эти изменения апоптоза периферических лимфоцитов и моноцитов при гестозе определяются угнетением синтеза XIAP лимфоцитами и снижением влияния TGFв2 в результате нарушения экспрессии его рецепторов, либо в результате недостаточного уровня его продукции, как это отмечалось при легкой степени гестоза.
При проведении иммуногистохимических исследований экспрессии проапоптотического белка р53 и антиапоптотического белка bcl-2 в различных структурах плаценты мы выявили различное распределение этих факторов в децидуальной оболочке и в хорионе плаценты как при беременности, протекавшей без гестоза, так и при гестозе. Так, нами впервые было показано, что в децидуальных клетках базальной пластинки экспрессия р53 и bcl-2 не определялась ни при неосложненной беременности, ни при гестозе. Как в норме, так и при гестозе белок р53 в максимальной степени накапливался в ядрах клеток цитотрофобласта в децидуальной базальной пластинки и в единичных клетках цитотрофобласта ворсин хориона.
Анализируя полученные нами данные, мы установили, что в контрольной группе проапоптотический белок р53 максимально экспрессировался в клетках цитотрофобласта базальной децидуальной оболочки (12% клеток), и в единичных случаях в цитотрофобласте в ворсинчатом хорионе (1 % клеток). С другой стороны, антиапоптотический белок Bcl-2 содержался в ворсинчатом хорионе, и не определялся в базальной децидуальной оболочке. Вероятно, в норме усиление экспрессии р53 и отсутствие выраженной продукции bcl-2 в базальной децидуальной оболочке является одним из механизмов отторжения плаценты во время родов, что подтверждается выводами других авторов [Adachi S. et al., 1997; Narita M. et al., 1998]. Нами так же отмечено увеличение проапоптотического белка р53 в группе женщин, беременность которых протекала на фоне легкого гестоза в базальной децидуальной оболочке. С другой стороны нами обнаружено увеличение количества антиапоптотического белка Bcl-2. Наблюдаемый нами дисбаланс между проапоптотическим и антиапоптотическим факторами совпадает и не противоречит ранее опубликованным сведениям о соотношении проапоптотических и антиапоптотических белков при легкой степени тяжести гестоза. Несомненно, дисбаланс между изучаемыми факторами является одной из этиологических причин развития гестоза.
Анализируя полученные нами данные, мы выявили повышенное содержание проапоптотического белка р53 в базальной децидуальной оболочке в группе женщин, беременность которых протекала на фоне тяжелого гестоза. Уровень антиапоптотического белка Bcl-2 в синцитиотрофобласте так же увеличивался с утяжелением гестоза. По нашему мнению, увеличение синтеза и секреции проапоптотического фактора в 4,3 раза по сравнению с контролем по мере утяжеления гестоза сопровождается повышением экспрессии антиапоптотического белка, что расценено как компенсаторная реакция в зонах формирования синцитиальных почек в связи с повышением интенсивности апоптоза цитотрофобластических клеток при тяжелой степени тяжести гестоза. Таким образом, по нашему мнению, развитие гестоза на локальном уровне сопровождается превалированием продукции про-апоптотических факторов при недостаточной компенсации со стороны антиапоптотических факторов. Вероятно, именно эти процессы приводят к усилению апоптоза. Отсутствие выраженной экспрессии р53 и bcl-2 в децидуальных клетках позволяют предположить, что митохондриальный путь апоптоза не играет существенной роли в их апоптозе. В цитотрофобластических клетках децидуальной базальной пластинки и ворсин хориона, как при неосложненной беременности, так и при гестозе, данный путь регуляции апоптоза представляется значимым. Это подтверждается нашими результатами о корреляции уровня экспрессии р53 в клетках цитотрофобласта в децидуальной базальной пластинке и в ворсинах хориона с развитием гестоза.
При развившемся гестозе нами отмечалось нарушение созревания ворсинчатого хориона по диссоциированному типу. При гестозе обращала на себя внимание неравномерная толщина цитотрофобластического слоя в базальной децидуальной оболочке за счет чередования участков истончения, где клетки располагались в 2-3 ряда, с зонами цитотрофобластической пролиферации. Количество эозинофильных, активно секретирующих форм клеток цитотрофобласта, в базальной пластинке несколько меньше количества больших децидуальных клеток.
Исследование апоптоза иммунных клеток в плаценте показало, что при легкой и тяжелой степени гестоза по сравнению с показателями контрольной группы повышалось содержание AnnexinV+ (p<0,01 и p<0,001, соответственно) и AnnexinV+PI- (p<0,02 и p<0,001, соответственно) децидуальных лимфоцитов. Только при гестозе легкой степени в децидуальной оболочке плаценты также как и в периферической крови, отмечалось увеличение количества лимфоцитов, находящихся на необратимых этапах апоптоза, но лишь на уровне тенденции (p>0,05). Для децидуальных макрофагов при гестозе было характерным, достоверное повышение уровня клеток, находящихся на ранних этапах апоптоза (p<0,02 в группе с легким гестозом и p<0,001 в группе с тяжелым гестозом) и тенденция к снижению уровня клеток, находящихся на поздних этапах апоптоза (p>0,05 в обоих случаях).
Эти изменения характера апоптоза иммунных клеток в тканях плаценты могли вызывать те же патологические реакции со стороны активированных цитотоксических клеток, В-лимфоцитов и макрофагов, которые отмечаются на системном уровне.
В отличие от периферической крови при неосложненной беременности и при гестозе децидуальные лимфоциты и макрофаги в высокой степени экспрессировали мРНК проапоптотического белка APAF, уровень экспрессии XIAP соответствовал таковому в периферической крови. Причем, при гестозе в децидуальной оболочке плаценты отмечалось многократное усиление синтеза проапоптотического белка APAF лимфоцитами (7,181,28 в контрольной группе, 36,599,40 в группе с гестозом, p<0,05) и макрофагами (7,77±2,18 в контрольной группе, 33,67±8,05 в группе с гестозом, p<0,01). Характер экспрессии мРНК XIAP децидуальными лимфоцитами и макрофагами при гестозе не отличался от такового при неосложненной беременности (p>0,05).
Полученные нами данные о повышении синтеза APAF свидетельствовали об усилении митохондриального пути апоптоза иммунными клетками на уровне децидуальной оболочки плаценты и о высокой значимости XIAP в регуляции этого процесса. Отмеченные нами особенности синтеза про- и анти-апоптотического белков на уровне децидуальной оболочки плаценты показали, что при неосложненной беременности в популяциях лимфоцитов и макрофагов также как и в периферической крови преобладало апоптоз-ингибирующее влияние XIAP, в то время как при гестозе превалировало апоптоз-активирующее влияние APAF. Это позволило нам предположить, что при гестозе на уровне децидуальной оболочки плаценты механизмы инициации апоптоза лимфоцитов и макрофагов значительно отличались от аналогичных в периферической крови, а усиление апоптоза иммунных клеток определялось высоким уровнем экспрессии APAF.