Основная ошибка, допускаемая при окраске по методу Грама, заключается в "переобесцвечивании" мазка этиловым спиртом. Грамположительные бактерии при этом могут утрачивать первоначальную окраску генциановым фиолетовым и приобретать красный цвет (характерный для грамотрицатель-ных бактерий) в результате последующей докраски мазка фуксином. Грамотрицательные бактерии в свою очередь могут сохранять сине-фиолетовый цвет генцианового фиолетового. Для правильной окраски следует строго соблюдать технику обесцвечивания.
Окраска кислотоустойчивых бактерий по методу Циля-Нильсена
На фиксированный мазок нанести карболовый раствор фуксина через полоску фильтровальной бумаги и подогреть 3-5 мин до появления паров.
Снять бумагу, промыть мазок водой.
Нанести 5 % раствор серной кислоты или 3 % раствор смеси спирта с хлористоводородной кислотой на 1-2 мин. для обесцвечивания.
Промыть водой.
Докрасить мазок водным раствором метиленового синего в течение 3-5 мин.
Промыть водой, высушить и микроскопировать.
В основе метода лежат протравливание (разрыхление) клеточной стенки бактерий для усиления поглощения красителя и избирательное обесцвечивание под действием кислоты. Кис-лотоустойчивость бактерий обусловлена особым строением их клеточной стенки с повышенным содержанием липидов: разветвленных жирных кислот (миколовых кислот), глико- и фос-фолипидов, восков. Клеточная стенка кислотоустойчивых бактерий имеет очень низкую проницаемость, поэтому они плохо воспринимают красители. Раствор карболовой кислоты разрыхляет клеточную стенку и тем самым повышает ее тинк-ториальные свойства, а высокая концентрация красителя и нагревание в процессе окраски усиливают реакцию взаимодействия красителя с бактериальными клетками, которые при этом окрашиваются в красный цвет. При обработке препарата серной кислотой некислотоустойчивые бактерии обесцвечиваются и в дальнейшем окрашиваются метиленовым синим в голубой цвет, а кислотоустойчивые бактерии остаются окрашенными фуксином в красный цвет (рис. 2.2.2; на вклейке).
Окраска спор по методу Ожешко
На нефиксированный мазок нанести 0,5 % раствор хлористоводородной кислоты и подогреть в течение 2-3 мин. на пламени.
Кислоту слить, препарат промыть водой, просушить и фиксировать над пламенем.
Окрасить по методу Циля-Нильсена.
Споры бактерий приобретают красный цвет, а вегетативные формы — синий (рис. 2.2.3; на вклейке). Споры бактерий имеют многослойную клеточную стенку сложного строения, практически непроницаемую для красителей, поэтому для повышения их тинкториальных свойств используют более жесткие условия протравливания, чем для окрашивания кислотоустойчивых бактерий.
Окраска спор по методу Шеффера-Фултона
На фиксированный мазок нанести 5 % раствор малахитового зеленого и 3-4 раза нагреть до появления паров.
Промыть водой.
Докрасить 0,5 % сафранином в течение 30 с.
4. Промыть водой, высушить и микроскопировать. Споры бактерий окрашиваются в зеленый цвет, вегетативные клетки — в красный.
Окраска зерен волютина по методу Нейссера
На фиксированный мазок нанести ацетат синьки Нейссера на 2-3 мин.
Добавить раствор Люголя на 10-30 с.
Промыть препарат водой.
Докрасить водным раствором везувина или хризоидина в течение 0,5-1 мин.
Промыть препарат водой, высушить и микроскопировать.
Зерна волютина представляют собой включения полифосфатов, имеющие в отличие от цитоплазмы щелочную реакцию, и поэтому избирательно воспринимают ацетат синьки, окрашиваясь в темно-синий цвет. Цитоплазма клетки, обладающая кислой реакцией, воспринимает щелочной краситель везувин и окрашивается в желтый цвет (рис. 2.2.4; на вклейке). Обнаружение макрокапсул по методу Бури-Гинса
Смешать каплю взвеси микробных клеток с каплей туши и при помощи стекла со шлифованым краем сделать мазок таким же образом, как мазок из крови, высушить и фиксировать.
На мазок нанести водный раствор фуксина на 1—2 мин.
Промыть водой, высушить на воздухе и микроскопировать.
Бактерии окрашиваются в красный цвет. Капсулы не окрашиваются анилиновыми красителями, остаются прозрачными и контрастно выделяются на черно-розовом фоне (рис. 2.2.5; на вклейке).
Тема 2.3. МОРФОЛОГИЧЕСКИЕ ОСОБЕННОСТИ
И УЛЬТРАСТРУКТУРА АКТИНОМИЦЕТОВ И СПИРОХЕТ
Введение. Актиномицеты (Actinomyces) относятся к порядку Actinomycetales, включающему семейства Actinomycetaceae, Strep-tomycetaceae и Nocardiaceae. Актиномицеты имеют нитевидную форму. Они способны к ветвлению и могут образовывать структуры, напоминающие мицелий одноклеточных грибов (рис. 2.3.1). Встречаются также палочко- и кокковидные формы. Нити имеют длину 100—600 мкм и толщину 0,2—1,2 мкм. Актиномицеты неподвижны, лишены выраженной капсулы, жгутиков и пилей. Как и другие бактерии, актиномицеты окрашиваются простыми методами или по методу Грама. Актиномицеты относятся к фирмикутным бактериям и окрашиваются грамположительно. В отличие от других бактерий они способны размножаться не только поперечным делением, но и спорами.
Спирохеты относятся к порядку Spirochaetales. Они представляют собой извитые подвижные бактерии. Патогенные спирохеты входят в семейство Spirochaetaceae и принадлежат к трем родам: Borrelia, Treponema и Leptospira. Их основные морфологические признаки представлены в табл. 2.3.1.
Клетка спирохеты имеет форму нити, закрученной в виде спирали. Клеточная стенка обладает строением, типичным для грациликутных бактерий. В периплазматическом пространстве располагаются сократительные фибриллы — эндофлагеллы, которые прикрепляются к полюсам клетки с обоих концов, оплетают тело бактерии по направлению к центру клетки, где они переплетаются между собой. Фибриллы обладают сокра-
|
Таблица 2. 3.1. Морфологические признаки спирохет Род Число и характер Характер движения Окраска по методу завитков Романовского— Гимзы Borrelia 3—10, крупные, Толчкообразное, Сине-фиолетовая неравномерные сгибательно-по-ступательное Treponema 8—12, мелкие, Плавное, сгиба- Бледно-розовая равномерные тельно-поступа-тельное Leptospira Многочисленные Очень активное, Розово-сиренева-первичные завит- вращательно-по- тая ки, вторичные ступательное завитки в виде буквы S |
План
Программа
Определение формы актиномицетов в препарате, окрашенном по методу Грама.
Методы изучения морфологии спирохет с дифференциацией по морфологическим признакам.
Определение формы и подвижности спирохет в прижизненных препаратах.
Исследование спирохет в окрашенных препаратах.
Изучение электронограмм спирохет и спирилл.
Демонстрация
Препарат из чистой культуры актиномицетов. Окраскапо методу Грама.
Подвижность лептоспир (темнопольная микроскопия).
Боррелии в препарате толстой капли крови (окраска по методу Романовского-Гимзы).
а Задание студентам
Изучить морфологию актиномицетов в препарате. Зарисовать.
Изучить морфологию лептоспир с помощью методатемнопольной микроскопии. Зарисовать.
Изучить морфологию боррелий в препарате толстой капли крови. Зарисовать.
Методические указания
Морфологию спирохет изучают в нативных препаратах и в мазках, окрашенных по методу Романовского-Гимзы. Препараты исследуют с помощью темнопольной или фазово-кон-трастной микроскопии, наблюдая за активным и характерным движением спирохет и особенностями их формы.
Приготовление мазка из крови. На чистое обезжиренное стекло ближе к одному из его концов поместить каплю крови. Другое предметное стекло со шлифованым краем прижать под углом 45° к капле крови, а затем скользящим движением передвинуть его к другому концу нижнего стекла. При этом кровь распределится по предметному стеклу тонким слоем. Высушить препарат на воздухе, фиксировать в жидком фиксаторе (метиловый спирт или смесь этилового спирта и эфира).
Окраска препарата по методу Романовского-Гимзы (смесь метиленового синего, эозина и азура). На мазок нанести рабочий раствор красителя (2 капли красителя на 1 мл дистиллированной воды) на 10—20 мин. Затем препарат промыть водой и высушить на воздухе.
Боррелии — возбудители возвратного тифа (B.recurrentis) окрашиваются в фиолетовый, эритроциты крови — в розово-коричневый, ядра лейкоцитов — в фиолетовый цвет. Трепонемы окрашиваются в бледно-розовый, лептоспиры — в розово-сиреневатый цвет.
|
Признак Риккетсии Хламидии Микоплазмы Размеры, 0,5— 4 мкм, поли- 0,25— 1,0 мкм, 0,2— 0,3 мкм, круг-форма морфны: встреча- шаровидные, ово- лые, овальные ются кокковид- идные или палоч- или нитевидные ные, палочковид- ковидные клетки* клетки ные, реже нитевидные клетки Особен- КС по типу фа- КС по типу гра- Лишены КС. Име-ности циликутных. Не циликутных; ли- ют выраженный строения имеют макрокап- шены пептидо- S-слой. Не имеют сулы, жгутиков, гликана. Не име- макрокапсулы, Неподвижны. Не ют макрокапсу- жгутиков. Не об-образуют споры лы, жгутиков. Не- разуют споры, подвижны. Не об- Подвижны за счет разуют споры внешнего цито-скелета Окраска По методу Здро- По методу Рома- — довского невского— Гимзы (микроколонии внутри клеток) Методы Световая, фазово- Световая, фазово- Электронная мик-выявле- контрастная, лю- контрастная, лю- роскопия ния минесцентная, минесцентная электронная мик- (для выявления роскопия микроколонии внутри клеток); электронная микроскопия |
План
Программа
1. Изучение морфологии риккетсий, хламидий и мико-плазм.
Демонстрация
Хламидий в инфицированных клетках эпителия уретры, мазках-отпечатках из органов и культурах клеток.
Электронограммы риккетсий, хламидий и микоплазм.
Задание студентам
Изучить морфологию риккетсий в препарате, окрашенном по Здродовскому.
Изучить морфологию хламидий.
3. Изучить морфологию микоплазм.
Методические указания
Окраска риккетсий по методу Здродовского
Окрасить мазок разведенным фуксином Циля (10—15 капель на 10 мл дистиллированной воды) в течение 5 мин.
Промыть водой.
Обработать мазок 0,5 % раствором лимонной кислоты или 0,01 % раствором хлористоводородной кислоты.
Промыть водой.
Окрасить метиленовым синим в течение 1 мин.
Промыть водой и высушить препарат.
Риккетсий, окрашенные по методу Здродовского, имеют красный цвет, цитоплазма клеток, в которых они паразитируют, — голубая, ядра — синие.
Глава 3
ФИЗИОЛОГИЯ БАКТЕРИЙ
Введение. Бактерии в ходе эволюции освоили различные экологические ниши и приспособились к соответствующим источникам неорганических и органических веществ, наличию кислорода, температуре и другим факторам окружающей среды. Создание условий, подходящих для выращивания (культивирования) микробов, необходимо для изучения их свойств и диагностики вызываемых ими заболеваний. Культивирование бактерий лежит в основе бактериологических методов исследования.
Питательные
среды. Применяют для выращивания
(культивирования) микроорганизмов
в лабораторных или промышленных
условиях. Любая питательная среда должна
отвечать сле
дующим требованиям:
— содержать все необходимые для роста и размножения бактерий вещества в легкоусвояемой форме;
— иметь оптимальные для бактерий физико-химические свойства: рН, влажность, осмолярность и др.
Компоненты питательных сред. Для построения органических компонентов микробной клетки необходимы азот, углерод, водород и кислород. Снабжение водородом и кислородом осуществляется за счет воды. В качестве источника углерода гетеротрофные микроорганизмы используют органические соединения, в первую очередь сахара, многоатомные спирты и органические кислоты. Источником азота могут служить неорганические соединения (соли аммония), а также олигопептиды и аминокислоты — продукты гидролиза белков различного происхождения (животного — мясо, рыба, казеин; растительного — соевые бобы, горох; микробного — дрожжи и др.).
Поскольку в состав микробных клеток входят не только органические, но и минеральные соединения, питательные среды должны содержать неорганические вещества: соединения хлора, фосфора, серы, натрия, калия, кальция, магния и некоторые другие. Минеральные соли необходимы также для создания оптимальных для роста и размножения физико-химических условий (рН, ионная сила и т.д.).
Микробам для нормального развития необходимы микроэлементы, преимущественно металлы (железо, медь, марганец и др.), которые входят в состав простетических групп молекул различных ферментов.
Кроме основных компонентов питательной среды, для жизнедеятельности ауксотрофных микроорганизмов, к числу которых относятся многие патогенные бактерии, требуется присутствие факторов роста — органических соединений, входящих в состав микробной клетки, но не синтезируемых ею самостоятельно. В качестве факторов роста могут выступать определенные аминокислоты, азотистые основания, витамины и др. Большинство бактерий нуждается в таких факторах роста, как витамины группы В и никотиновая кислота. Для роста некоторых патогенных бактерий в питательные среды надо добавлять нативные белки (кровь, сыворотку).
Для жизнедеятельности микробной клетки, безусловно, необходима вода как основной растворитель и среда для протекания всех биохимических реакций.
В бактериологической практике используют среды, различные по происхождению. Синтетическими питательными средами называют такие, которые состоят из растворов химически чистых соединений в точно установленных дозировках. Преимуществом синтетических сред являются их строго постоянный состав и воспроизводимость. Полусинтетические среды включают наряду с химически чистыми соединениями перера-ботанные нативные компоненты неопределенного состава — гидролизаты мяса, дрожжевой экстракт и т.д. Натуральные питательные среды представляют собой неизмененные нативные (природные) компоненты (сыворотка крови, яичный белок и др.).
Различные потребнрсти микробов отдельных видов обусловливают большое разнообразие питательных сред.
По консистенции питательные среды могут быть жидкими, полужидкими, плотными. Для придания плотной консистенции к жидкой среде добавляют агар-агар, представляющий собой продукт переработки особого вида морских водорослей. Агар-агар плавится при 80—86 °С, затвердевает при температуре около 40 "С и в застывшем состоянии придает среде плотность. В плотные среды добавляют 1,5—2 %, в полужидкие — 0,3—0,7 % агар-агара. В некоторых случаях для получения плотных питательных сред используют нативные компоненты (свернувшаяся сыворотка крови, свернувшийся яичный белок), которые сами по себе являются плотными.
Преимуществом плотных питательных сред является возможность получения чистых культур микроорганизмов, а также сообществ микроорганизмов (колоний, бактериальных газо- .s нов), имеющих макроскопические размеры.
По целевому назначению питательные среды делят на основные, элективные и дифференциально-диагностические.
К основным относятся среды, применяемые для выращивания многих бактерий. Это триптические гидролизаты мясных, рыбных продуктов, крови животных или казеина, из которых готовят жидкую среду — питательный бульон и плотную — питательный агар. Такие среды также служат основой для приготовления сложных питательных сред — сахарных, кровяных и др., удовлетворяющих пищевые потребности патогенных бактерий.