Материал: Тец руководство

При микроскопии препаратов с иммерсионным объективом следует строго придерживаться определенного порядка:

на приготовленный на предметном стекле и окрашенный мазок нанести каплю иммерсионного масла и поместить его на предметный столик, укрепив зажимами;

повернуть револьвер до отметки иммерсионного объек­тива 90х или 100х;

3) осторожно опустить тубус микроскопа до погруженияобъектива в каплю масла;

установить ориентировочный фокус при помощи макрометрического винта;

провести окончательную фокусировку препарата микро­метрическим винтом, вращая его в пределах только одного оборота. Нельзя допускать соприкосновения объектива с пре­паратом, так как это может повлечь поломку покровного стек­ла или фронтальной линзы объектива (свободное расстояние иммерсионного объектива 0,1-1 мм).

По окончании работы микроскопа необходимо удалить мас­ло с иммерсионного объектива и перевести револьвер на малый объектив 8х.

Для темнопольной и фазово-контрастной микроскопии ис­пользуют нативные препараты ("раздавленная" капля и др., см. тему 2.1); микроскопируют с объективом 40х или специальным иммерсионным объективом с ирис-диафрагмой, позволяющей регулировать численную апертуру от 1,25 до 0,85. Толщина предметных стекол не должна превышать 1-1,5 мм, покров­ных – 0,15-0,2 мм.

Введение. Бактерии относятся к доминиону Bacteria. Они являются одноклеточными прокариотическими (доядерными) организмами. Бактериальная клетка обладает характерными особенностями строения (ультраструктуры) и существенно от­личается от эукариотической.

Бактерии имеют микроскопические размеры, большинство — в пределах разрешающей способности светооптической микро­скопии (превышают 0,2 мкм), однако существуют и более мелкие формы.

Форма клетки относится к числу важных таксономических признаков бактерии. По форме клеток бактерии подразделяют на шаровидные, палочковидные, нитевидные и извитые (рис. 2.1).

Шаровидные бактерии — кокки (coccus — зерно) имеют правильную сферическую или эллипсоидную форму. Кокки могут образовывать характерные скопления, что обусловлено особенностями их деления и способностью дочерних клеток сохранять связь друг с другом после деления. Кокки могут располагаться беспорядочно (микрококки), парами (диплокок­ки), в виде цепочек из 3 и более кокков (стрептококки), в виде пакетов, состоящих из 4 (тетракокки) и 8 (сарцины) кокков, и в виде скоплений, напоминающих виноградную гроздь (стафи­лококки).

Диплококки и стрептококки образуются при делении в одной плоскости, если дочерние клетки могут не отходить друг от друга. Упорядоченное деление в 2 и 3 плоскостях приводит к образованию тетракокков и сардин. При делении в разных плоскостях образуются стафилококки.

Палочковидные бактерии (бациллы) различаются по разме­рам, форме клеток и их концов, а также по расположению. Они могут быть тонкими, утолщенными на концах либо с обрубленными концами. Одни располагаются в виде одиноч­ных клеток, другие парами — диплобактерии, третьи в виде цепочек — стрептобактерии.

Извитые формы бактерий представлены изогнутыми палоч­ками, имеющими V4~~V2 завитка (вибрионы) или несколько (1-3) завитков (спириллы), и спиралевидными бактериями (спирохеты). Нитевидные и ветвистые формы характерны для актиномицетов.

Бактерии не имеют дифференцированного ядра. Нуклеоид бактерий — аналог ядра — не окружен мембраной и располага­ется в цитоплазме. Бактерии лишены внутриклеточных мем­бран и ограниченных ими органелл. Плазматическая мембрана (ПМ) является единственной мембраной, присущей всем бак­териальным клеткам. В цитоплазме бактерий свободно распо­лагаются рибосомы, могут также присутствовать включения и споры (рис. 2.2). Последние могут располагаться терминально, субтерминально и центрально. Снаружи от ПМ находится клеточная стенка (КС). По строению КС бактерии подраз­деляют на 2 группы: фирмикутные и грациликутные. КС может быть покрыта капсулой или капсулоподобной оболоч-

и др.)- Для выявления различных структур бактериальной клет­ки применяют нейтральные и кислые красители.

Различают простые и сложные методы окраски. Простые методы заключаются в окраске препарата одним красителем и позволяют изучать форму и размеры бактерий. Сложные мето­ды (по Граму, Цилю—Нильсену и др.) включают последова­тельное использование нескольких красителей и дополнитель­ных способов обработки препаратов. Тинкториальные свой­ства — способность воспринимать и удерживать красители — зависят от особенностей строения и химического состава бак­териальной клетки. Сложные методы окраски позволяют диф­ференцировать бактерии по этим признакам и имеют диагнос­тическое значение. Существуют специальные сложные методы окраски, которые используют для выявления структурных ком­понентов бактерий: жгутиков, капсул и разных цитоплазматичес-ких включений.

Методы темнопольной и фазово-контрастной микроскопии дают возможность прижизненного изучения бактерий, в част­ности их подвижности. Для этого готовят нативные (прижиз­ненные) препараты.

Электронную микроскопию используют для изучения ульт­раструктуры (тонкой организации) бактерий.

Тема 2.1. ИЗУЧЕНИЕ МОРФОЛОГИИ БАКТЕРИЙ И ИХ ТИНКТОРИАЛЬНЫХ СВОЙСТВ. ПРОСТЫЕ МЕТОДЫ ОКРАСКИ

План

Программа

Морфология бактерий и методы ее изучения.

Подвижность бактерий и методы ее изучения.

Простые методы окраски препаратов.

Определение размеров бактерий.

Демонстрация

Приготовление мазков из бактериальных культур.

Красители, используемые в микробиологии.

Подвижность бактерий в препарате "висячая" капля.

Задание студентам

Микроскопировать и зарисовать готовые мазки, окра­шенные простым методом (стафилококки, стрептококки, сарцины, палочки, стрептобациллы).

Приготовить мазки из бактерий, выращенных на жид­кой и плотной питательных средах.

Окрасить мазки простым методом.

Микроскопировать и дифференцировать бактерии в мазках по основным морфологическим признакам и зарисовать их. 5. Определить размеры бактериальной клетки.

Методические указания

Приготовление препаратов для микроскопического исследова­ния. Для приготовления препарата исследуемый материал берут из пробирки, колбы или чашки Петри бактериологической петлей или стерильной пипеткой. В некоторых случаях исполь­зуют препаровальные иглы.

Петлю прокаливают в пламени горелки для уничтожения посторонних бактерий. Вращательным движением вынимают из пробирки ватную пробку, прижимая ее V и IV пальцами к ладони, и обжигают край пробирки. Осторожно вводят петлю в пробирку, охлаждая ее о внутреннюю поверхность стекла, после чего легким скользящим движением захватывают мате­риал. Затем вынимают петлю из пробирки, снова обжигают край пробирки и закрывают пробкой. После приготовления препарата петлю обязательно прожигают (стерилизуют) в пла­мени. Жидкий материал из пробирки или колбы можно наби­рать пипеткой.

Приготовление нативных препаратов для прижизненного изу­чения микроорганизмов. Метод "висячей" капли. Пре­парат готовят на покровном стекле, в центр которого наносят одну каплю исследуемого материала. Затем предметное стекло с лункой, края которой предварительно смазывают вазелином, прижимают к покровному стеклу так, чтобы капля находилась в центре лунки. Быстрым движением переворачивают препарат покровным стеклом вверх. В правильно приготовленном пре­парате капля должна свободно висеть над лункой, не касаясь ее дна или края. Для микроскопии вначале используют объек­тив малого увеличения (8х или 10х), находят край капли, а затем устанавливают объектив 40х или иммерсионный и ис­следуют препарат. Определяют подвижность бактерий.

Метод "раздавленной" к а пли. На поверхность обез­жиренного предметного стекла наносят каплю исследуемого материала или суспензию бактерий и покрывают ее покровным стеклом. Капля должна быть небольшой, не выходящей за край покровного стекла.

Прижизненная (витальная) окраска. Взвесь мик­роорганизмов вносят в каплю 0,001 % раствора метиленового синего или нейтрального красного. Затем готовят препарат "висячая" или "раздавленная" капля и микроскопируют.

После микроскопии препараты "раздавленной" или "вися­чей" капли опускают в дезинфицирующий раствор.

Приготовление фиксированных препаратов-мазков. Для при­готовления препарата на обезжиренное предметное стекло на­носят суспензию (взвесь) бактерий. Если мазок готовят из

жидкой питательной среды, то материал непосредственно на­носят петлей на предметное стекло и распределяют его так, чтобы получить тонкий мазок. В других случаях первоначально на предметное стекло наносят каплю воды или изотонического раствора хлорида натрия, в которую петлей вносят исследуе­мый материал и готовят взвесь. При правильном распределе­нии материала в мазке при микроскопии видны изолирован­ные бактериальные клетки. Мазки высушивают на воздухе или в струе теплого воздуха над пламенем горелки, не давая капле закипать.

Фиксация препарата. Высушенные мазки подвергают термической или химической обработке, в результате которой бактерии погибают и плотно прикрепляются к поверхности стекла. Обычно для фиксации мазка предметное стекло про­водят несколько раз через пламя горелки (мазком вверх).

Мазки крови, мазки-отпечатки из органов фиксируют по­гружением на 5-20 мин в метиловый или этиловый спирт или другие фиксирующие жидкости.

Окраска препаратов простым методом. Фиксированный мазок окрасить каким-либо одним красителем, например фук­сином водным (1-2 мин) или метиленовым синим (3-5 мин), промыть водой, высушить и микроскопировать.

Приготовление и окраска препаратов для люминесцентной микроскопии. Для люминесцентной микроскопии на предмет­ных стеклах готовят фиксированные препараты-мазки или на-тивные препараты, которые окрашивают специальными флю­оресцентными красителями: акридиновым желтым, акридино­вым оранжевым, ауромином, корифосфином. При работе с иммерсионным объективом используют нефлюоресцирующее масло.

Приготовление препаратов для электронной микроскопии. Приготовление препаратов для исследования в электронном микроскопе имеет ряд особенностей. Препараты готовят на специальных пленках-подложках, так как стекло непроницае­мо для электронов. Исследуемый объект максимально очища­ют от посторонних примесей и наносят на пленку-подложку, предварительно помещенную на опорную металлическую се­точку. Для контрастирования применяют соединения тяжелых металлов (золото, осмий, рутений и др.).

Измерение микробных клеток. Измерение микробов осущест­вляют в ходе микроскопического исследования с помощью специальных приспособлений. Для измерения применяют оку­ляр-микрометр и объект-микрометр. Окуляр-микрометр слу­жит для непосредственного измерения объекта и представляет собой стеклянную пластинку в окуляре, в центральной части которой нанесена шкала с 50 делениями. Объект-микрометр представляет собой стекло, в середине которого имеется эта­лонная шкала, разделенная на 100 частей. Цена деления шкалы

Спорообразующие бактерии (окраска по методу Шеффера—Фултона).

Зерна волютина в клетках Corynebacterium diphtheriae (окраска по методу Нейссера).

Задание студентам

Микроскопировать и дифференцировать бактерии по морфологическим и тинкториальным свойствам в го­товом препарате из смеси бактерий (окраска по методу
Грама). Зарисовать.

Самостоятельно приготовить мазки из смеси бакте­рий, окрасить по методу Грама, Микроскопировать и дифференцировать бактерии по морфологическим признакам и тинкториальным свойствам. Зарисовать.

Микроскопировать и зарисовать:

капсулы (окраска по методу Бурри—Гинса);

С.diphtheriae, содержащие зерна волютина (окраска по методу Нейссера);

кислотоустойчивые бактерии М. tuberculosis (окраска по методу Циля—Нильсена);

спорообразующие бактерии (окраска по методу Шеффера—Фултона).

4. Сделать заключение по результатам проведенных исследований.

Методические указания

Сложные методы окраски. Сложные методы окраски исполь­зуют для выявления ультраструктурных компонентов бактери­альных клеток, имеющих достаточно большие размеры (мак­рокапсулы, жгутики, цитоплазматические включения и т.д.), а также для дифференцировки (различения) бактерий в зависи­мости от химического состава и особенностей их тонкой орга­низации (ультраструктуры).

Окраска по методу Грама

На фиксированный мазок нанести карболово-спиртовой раствор генцианового фиолетового через полоску фильт­ровальной бумаги. Через 1—2 мин ее снять, а краситель
слить.

Нанести раствор Люголя на 1-2 мин.

Обесцветить этиловым спиртом в течение 30-60 с до прекращения отхождения фиолетовых струек красителя.

Промыть водой.

Докрасить водным раствором фуксина в течение 1-2 мин, промыть водой, высушить и Микроскопировать.

Грамположительные бактерии окрашиваются в темно-фио­летовый цвет, грамотрицательные — в красный (рис. 2.2.1; на вклейке). В основе этого метода лежит избирательное обесцве­чивание — удаление комплекса генцианового фиолетового с йодом под действием спирта. Результат окраски по методу Грама определяется особенностями строения и химического состава клеточной стенки бактерий и зависит от способности удерживать образовавшийся в процессе окраски комплекс генцианового фиолетового с йодом.

Фирмикутные бактерии окрашиваются грамположительно, поскольку имеют многослойный пептидогликан, связанный с тейхоевыми кислотами. Последние обусловливают прочную фиксацию красителя и резистентность к обесцвечиванию спир­том. Грациликутные бактерии окрашиваются грамотрица-тельно.

Окраска по методу Грама имеет важное дифференциально-диагностическое значение и широко используется в микробио­логии. К грамположительным бактериям относятся стафило­кокки, стрептококки, коринебактерии дифтерии и др., к грамотрицательным — гонококки, менингококки, кишечная палоч­ка и др. Некоторые виды бактерий (клостридии, гарднереллы) могут окрашиваться по методу Грама вариабельно в зависимос­ти от возраста культуры, особенностей культивирования и дру­гих факторов, воздействующих на структуру клеточной стенки.