Материал: РСК (практика)

Методы оценки иммунного статуса

Иммунный статус – это структурное и функциональное состояние иммунной системы индивидуума, определяемое комплексом клинических и лабораторных иммунологических показателей.

Оценка иммунного статуса включает количественную и качественную оценку основных факторов неспецифической защиты (фагоцитов, системы комплемента, естественных киллеров и др.), гуморального (В-система) и клеточного (Т-система) иммунитета.

Диагностику иммунологических расстройств начинают с анализа лейкограммы, результаты которой могут свидетельствать о патологических процессах, сопровождающихся иммунологической недостаточностью.

На следующем этапе оценивается иммунограмма для определения характера иммунологических расстройств.

Некоторые иммунологические тесты сложны для исполнения, требуют дорогостоящих реагентов и лабораторного оборудования, а также высокой квалификации персонала. Поэтому по рекомендации Р.В. Петрова все тесты разделены на 1-й и 2-й уровни.

К тестам 1-го уровня отнесены основные показатели состояния иммунной системы, они служат для первичного выявления лиц с иммунопатологией. Тесты 2-го уровня служат для более точной диагностики выявленных отклонений в состоянии иммунной системы.

Тесты для оценки ИС

Тесты 1-го уровня:

*Определение количества лимфоцитов в периферической крови (абс.,%)

*Определение количества Т- и В-лимфоцитов (абс.,%)

*Определение основных классов сывороточных иммуноглобулинов (IgG, IgA, IgM)

*Оценка фагоцитарной активности нейтрофиллов

*Определение титра комплемента

После анализа результатов тестов 1-го уровня определяют тактику дальнейшего исследования. Тесты 2-го уровня ставят уже избирательно. Они могут включать:

*Определение субпопуляций Т- и В-лимфоцитов (Тх, Тс)

*Определение функциональной активности Т- и В-лимфоцитов в реакции бласттрансформации лимфоцитов (РБТЛ)

*Определение специфических IgE

*Определение циркулирующих иммунных комплексов (ЦИК)

*Определение компонентов комплемента

*Определение синтеза и секреции цитокинов и т.д.

Для оценки состояния факторов неспецифической резистентности определяют состояние системы фагоцитоза и комплемента.

Количественную оценку фагоцитарной активности гранулоцитов и моноцитов проводят с использованием лейкоцитарной взвеси. Фагоцитирующие клетки смешивают с объектами фагоцитоза (частицы латокса, суспензия убитых нагреванием клеток бактерий) в соотношении 1:100 или 1:10. Инкубируют при 370 С при постоянном помешивании. Затем смесь центрифугируют и из осадка готовят мазок.

В мазке, окрашенном по Романовскому, подсчитывают: фагоцитарный показатель – процент фагоцитирующих клеток (норма 40-80%), фагоцитарное число – среднее количество поглощенных частиц на одну клетку (норма 1-5). В оценке фагоцитоза используют опсонофагоцитарный индекс-отношение фагоцитарных показателей, полученных с иммунной и неиммунной сывороткой. Должен быть в норме > 1.

Методы выделения лимфоцитов из периферической крови.

Лимфоциты из периферической крови выделяют методом градиентного центрифугирования. В качестве градиентов используют фиколл-верографин, верографин. Для этого венозную гепаринизированную кровь осторожно наслаивают на раствор градиента в силиконизированной посуде. Далее пробу подвергают цетрифугированию при определенном

режиме. В результате клетки крови разделяются на отдельные фракции.

Для оценки состояния клеточного звена иммунитета определяют количество Т- лимфоцитов, их субпопуляций, бласттрансформацию Т-лимфоцитов под действием Т- клеточных митогенов, уровень цитокинов, содержание гормонов тимуса, ставят кожные пробыс аллергенами (например, пробу Манту с туберкулином).

Число Т-лимфоцитов и их субпопуляций определяют методом спонтанного розеткообразования с эритроцитами барана (Е-РОК), иммунофлюоресцентным методом (ИФМ) с помощью моноклональных антител, методом проточной цитометрии.

Метод Е-РОК основан на наличии сродства между рецептором Т-лимфоцита и гликопротеинами мембраны эритроцита барана. При смешивании лимфоцитов и эритроцитов барана последние избирательно адсорбируются только Т-лимфоцитами, в результате чего образуются так называемые «Е-розетки». «Розеткой» считается лимфоцит, присоединивший не менее 3-х эритроцитов. Количество этих «розеток» соответствует количеству Т-лимфоцитов. У здоровых людей 40-70% Т-клеток от общего числа лимфоцитов. Абсолютное количество Т- лимфоцитов (АК) подсчитывают по формуле:

L х %Li х %Е-РОК

АК ═ —————————— , где:

104

L – абсолютное количество лейкоцитов,

Li – количество лимфоцитов в % (из гемограммы),

Норма: 0,7-1,4 × 109/л

Помимо определения количества Т-лимфоцитов и их субпопуляций, важное значение имеет соотношение регуляторных субпопуляций, т.е. хелперно-супрессорный индекс (СD4/СD8). Соотношение Т-хелперы/Т-супрессоры у здоровых людей составляет 1,8-2,2.

Определения соотношения Тх/Тс производят с помощью теофиллинового теста. В присутствии теофиллина Тс теряют способность к Е-розеткообразованию. Их называют теофиллинчувствительными. Тх являются теофиллинрезистентными и образуют Е-розетки.

Более точным методом для определения количества Т-лимфоцитов и их субпопуляций является ИФМ с применением меченых флюоресцином моноклональных антител меченых флюоресцином к антигенным детерминантам Т-лимфоцитов.

После совместной инкубации лимфоцитов с моноклональными антителами к специфическим СD3-рецепторам Т-лимфоцитов, готовят мазки, которые микроскопируют с помощью люминисцентного микроскопа. Обнаружение специфического свечения вокруг клеток

позволяет определить количество Т-лимфоцитов.

Для оценки функциональной активности Т-лимфоцитов используют реакцию бласттрансформации лимфоцитов (РБТЛ).

В основе РБТЛ лежит способность нормальных лимфоцитов периферической крови превращаться в недифференцированные зародышевые клетки типа бластов при культивировании их in vitro под действием специфических аллергенов и неспецифических стимуляторовмитогенов. Для активации Т-звена иммунитета используют митогены Кон-А, ФГА. Результаты учитываются через 48-72 часа. Чем больше бластных форм в мазках (окраска по РомановскомуГимза), тем выше функциональная активность Т-лимфоцитов. Норма: 4090%. Снижение показателей свидетельствует о патологии.

Для изучения гуморального звена иммунитета определяют содержание основных классов иммуноглобулинов в сыворотке, количество В-лимфоцитов в периферической крови, их бласттрансформацию под действием В-клеточных митогенов, титры специфических антител.

Для определения числа В-лимфоцитов в периферической крови используют кластерный анализ (выявление специфических СD-рецепторов с помощью моноклональных антител), метод спонтанного розеткообразования с эритроцитами мыши (М-РОК), проточную цитометрию. Реакции основаны на определении на поверхности этих лимфоидных клеток рецепторов,

характерных только для них. Характерной

особенностью В-лимфоцитов является наличие на их поверхности Ig рецепторов, рецепторов к комплементу (С3) и эритроцитам мыши.

Один из самых простых методов количественного учета В-лимфоцитов – метод спонтанного розеткообразования с эритроцитами мыши (М-РОК). При смешивании мышиных эритроцитов с лимфоцитами периферической крови человека эритроциты спонтанно присоединяются к поверхности В-клеток, в результате образуются розетки. Полученная смесь инкубируется в термостате, затем из нее готовится мазок и окрашивается по методу Романовского-Гимзы. В мазке подсчитывается количество розеток, что соответствует числу В- клеток в %.

Абсолютное количество В-лимфоцитов (АК) подсчитывают по формуле:

L х %Li х %М-РОК

АК ═ —————————— , где:

104

L – абсолютное количество лейкоцитов,

Li – количество лимфоцитов в % (из гемограммы),

Норма составляет 0,4 - 0,7 х 109/л.

Используется также ЕАС-РОК, которую ставят с эритроцитами быка, обработанными антиэритроцитарными антителами против них, а затем комплементом. Такие эритроциты адсорбируются избирательно на В-лимфоцитах, имеющих рецепторы к С3 фракции комплемента.

Более современным является ИФМ, в котором клетки идентифицируют с помощью моноклональных антител против соответствующих антигенных рецепторов В-лимфоцитов, выступающих в роли маркеров (CD-кластеры дифференциации). Все В-лимфоциты имеют

маркер CD19.

Функциональную активность В-лимфоцитов определяют в РБТЛ на ЛПС Гр- бактерий.

РП в геле методом радиальной иммунодиффузии (по Манчини)

Используется для определения концентрации иммуноглобулинов разных классов в сыворотке крови, компонентов комплемента и др. .

Рис. 6. Схема реакции радиальной иммунодиффузии по Манчини

В расплавленный агаровый гель добавляют иммунную сыворотку (например, антиглобулиновую сыворотку против иммуноглобулинов определенного класса) и наливают гель равномерным слоем на стекло. В застывшем геле вырезают лунки, в которые вносятантиген (например, исследуемую сыворотку с неизвестной концентрацией определяемого иммуноглобулина). В результате диффузии антигена и взаимодействии его с антителами в геле вокруг лунок образуются кольца преципитата. Диаметр кольца преципитации прямо пропорционален концентрации антител.

Показатели количества иммуноглобулинов разных классов для здоровых людей (г/л):

•Ig М – 0,65-1,65;

•IgG – 7,5-15,45;

•IgA – 1,25-2,5;

•IgD – 0-0,07;

•IgE – 0-0,0005.

Титр специфических антител определяют в серологических реакциях (описаны ранее).

Реакции с использованием меченых антител или антигенов

Ксовременным специфическим методам относятся серологические реакции с меткой. Все эти реакции основаны на специфическом взаимодействии антигенов и гомологичных им антител. Образующийся при этом иммунный комплекс выявляется с помощью особой метки, соединенной

сантигеном или антителом. Современные реакции высокочувствительны, могут регистрироваться специальными приборами, протекают быстрее (экспресс-методы) и качественнее.

Основные виды меток:

•светящиеся красители-флюорохромы; используются в реакции иммунофлюресценции

(РИФ);

•ферменты; используются в реакции иммуноферментного анализа (ИФА);

•радиоактивные изотопы; используются в реакции радиоиммунного анализа (РИА)

•электронно-плотные белки; используются в иммуноэлектронной микроскопии.

Реакции ставят в двух направлениях:

-для определения неизвестного антигена;

-для определения неизвестных антител.

Используют прямые и непрямые методы. Непрямой метод заключается в выявлении комплекса антиген-антитело с помощью антиглобулиновой (против антитела) сыворотки, имеющей метку.