Материал: РСК (практика)

РЕАКЦИЯ ЛИЗИСА И ГЕМОЛИЗА. РЕАКЦИЯ СВЯЗЫВАНИЯ КОМПЛЕМЕНТА. РЕАКЦИЯ ПРЕЦИПИТАЦИИ. ИММУНОЭЛЕКТРОФОРЕЗ. МЕТОДЫ ОЦЕНКИ ИММУННОГО СТАТУСА ОРГАНИЗМА.

Практическая часть

Иммунный лизис – процесс растворения микробных клеток с помощью специфических Ат (лизинов) в присутствии комплемента. Его вариантами являются бактериолиз и гемолиз.

Бактериолиз – лизис бактериальных клеток под действием бактериолизинов. Гемолиз – процесс разрушения эритроцитов под действием гемолизинов. Реакция бактериолиза широкого распространения не получила, т.к. большинство

бактерий устойчивы к лизису (чувствительны только спирохеты и холерные вибрионы). Явление гемолиза используется как индикатор в реакции связывания комплемента.

Реакция связывания комплемента (РСК)

РСК основана на связывании комплемента со специфическим комплексом антигенантитело. Это сложная двухэтапная серологическая реакция, в ней участвуют две системы и 5 компонентов: антиген, антитела, комплемент, эритроциты и гемолитическая сыворотка.

Приготовление и титрование ингредиентов для РСК

Гемолитическая сыворотка приготавливается в производственных институтах путем 3-4 кратной внутривенной иммунизации кроликов 50% взвесью бараньих эритроцитов. Полученную сыворотку инактивируют нагреванием при 56°С для инактивации собственного комплемента. На этикетке ампулы обозначен титр сыворотки – ее максимальное разведение, которое обеспечивает полный лизис 3% взвеси эритроцитов в присутствии комплемента при 37°С в течение часа.

Для РСК гемолитическую сыворотку берут в тройном титре, т.е. в таком разведении, в котором гемолизинов в три раза больше, чем в титре.

СХЕМА РЕАКЦИЙ ДЛЯ ОПРЕДЕЛЕНИЯ ТИТРА ГЕМОЛИТИЧЕСКОЙ СЫВОРОТКИ

Пример. Произведен учет реакции гемолиза, поставленной для определения титра гемолитической сыворотки. В разведениях сыворотки от 1/100 до 1/3200 наблюдается гемолиз, в разведениях 1/6400 и 1/12800 – задержка гемолиза, как в контрольной пробирке (К). Следовательно, титр гемолитической сыворотки равен 1/3200, её тройной титр будет равен

1/1067

Комплемент получают из свежей сыворотки морской свинки или используют сухой комплемент, который разводят физ. раствором. Титр комплемента определяют с помощью реакции гемолиза.

Титр комплемента – наименьшее его количество в мл, которое обеспечивает гемолиз при участии гемолитической сыворотки в тройном титре. В РСК комплемент берут в рабочей дозе, которая на 25% больше титра.

СХЕМА ПОСТАНОВКИ РЕАКЦИИ ДЛЯ ОПРЕДЕЛЕНИЯ ТИТРА КОМПЛЕМЕНТА

Примечание: гемолитическая система представляет собой смесь равных объемов гемолитической сыворотки в тройном титре и 3% взвеси эритроцитов барана в физиологическом растворе, выдержанную в термостате при 37°С

– 30 минут.

Пример. Произведен учет реакции гемолиза, поставленной для определения титра комплемента. Реакция положительная в пробирках № 1 – № 4 и отрицательная в пробирках № 5 и № 6 (контроль). Следовательно, титр комплемента равен 0,2 мл комплемента (разведенного 1/10), рабочая доза будет равна 0,25мл комплемента (в разведении 1/10).

Антигены изготавливают из убитых микроорганизмов, их лизатов, экстрактов тканевых липидов. Аг берут в рабочей дозе.

Взвесь эритроцитов барана получают из дефибринированной крови, отмывая эритроциты физ. раствором и готовят из них 3% взвесь.

Постановка основного опыта РСК

(для определения специфических антител в исследуемой сыворотке)

На первом этапе готовят две системы в разных пробирках.

Первая система (специфическая) состоит из микробного антигена и исследуемой сыворотки, в которой предполагается наличие антител. В неё вносят комплемент. При соответствии Аг и Ат они соединяются и связывают комплемент. Образовавшийся комплекс мелкодисперсный и визуально не выявляется.

Вторая система (гемолитическая, или индикаторная) служит для выявления этого комплекса. Она состоит из эритроцитов барана и соответствующей им гемолитической сыворотки. В этой системе лизис эритроцитов может произойти только в присутствии комплемента.

Все компоненты реакции берутся строго определенных соотношениях и количествах: по 0,5 мл и в рабочих дозах. Обе системы инкубируют в термостате 30 мин или 18-20 часов в холодильнике.

На втором этапе добавляют гемолитическую систему к специфической. Послеинкубации в термостате в течение 30 мин учитывают результат.

При положительной РСК антитела сыворотки, соединившиеся с антигеном, образуют иммунный комплекс, который связывает комплемент и гемолиза не происходит (в пробирке осадок эритроцитов в виде «пуговки»).

Если реакция отрицательная, т.е. антител в исследуемой сыворотке нет, комплемент остается свободным и вызовет гемолиз (в пробирке «лаковая кровь»).

Пример. Произведен учет РСК, поставленной с сыворотками больных №1 и №2.

РСК с сывороткой №1 (+), т.к. в опытной пробирке задержка гемолиза, следовательно, комплемент связан в специфической системе комплексом Аг-Ат, что свидетельствует о присутствии в сыворотке специфических Ат и подтверждает диагноз заболевания.

РСК с сывороткой №2 (-), т.к. в опытной пробирке полный гемолиз, следовательно, комплемент не связан в специфической системе, а реализован в гемолитической, т.е. в исследуемой сыворотке нет специфических Ат и диагноз заболевания не подтверждается.

Применение РСК

Диагностика

•сифилиса (реакция Вассермана)

•хронической формы гонореи (реакция Борде-Жангу)

•вирусных инфекций (гриппа, парагриппа, аденовирусной инфекций и т.д.)

•сыпного тифа

•лихорадки Ку

•лептоспироза

•коклюша

•бруцеллеза и др. инфекций

Реакция преципитации (РП)

РП – это иммунная реакция взаимодействия растворимого прозрачного Аг (преципитиногена) и специфических Ат (преципитинов) в присутствии электролита, приводящая к формированию иммунного комплекса, что проявляется образованием непрозрачного преципитата.

Существуют различные способы постановки РП:

•реакция кольцепреципитации;

•реакция в геле двойной иммунодиффузии по Оухтерлони;

•реакция в геле радиальной иммунодиффузии по Манчини;

•иммуноэлектрофорез.

Постановка РП в пробирках

(реакция кольцепреципитации)

-в преципитационную пробирку наливают 0,5 мл преципитирующей сыворотки (сыворотка берется цельной).

-осторожно по стенке пробирки на иммунную сыворотку по капле наслаивают неизвестный растворенный Аг. Его берут в эквивалентном количестве, Аг должен быть прозрачным.

При положительной реакции через несколько минут на границе двух жидкостей образуется белое кольцо преципитата.

Если в качестве антигенов в РП используют прокипяченные и профильтрованные экстракты органов или тканей, то такая реакция называется реакцией термопреципитации (реакция Асколи).

Реакция кольцепреципитации служит для выявления неизвестного антигена по известнойсыворотке и позволяет уловить растворимый Аг в очень малых концентрациях. Титром преципитирующей сыворотки в такой реакции называется то наибольшее разведение Аг, которое еще улавливается в реакции преципитации.

Практическое применение РП в пробирках

•диагностика сибирской язвы

•диагностика чумы

•диагностика туляремии

•в судебной медицине (для определения видовой принадлежности крови, спермы)

•в санитарной практике (для установления фальсификации продуктов)

Постановка РП в геле (по Оухтерлони)

Эта реакция проводится в агаровом геле. В чашку Петри наливают тонкий слой агара, в котором вырезают лунки на определенном расстоянии друг от друга и заполняют их соответственно антигеном и сывороткой. Например, в центральную лунку наливают известную сыворотку, а в периферические – определяемые антигены. Если антиген соответствует сыворотке, то в толще агара в результате иммунодиффузии между этими лунками образуются линии преципитата.

Иммуноэлектрофорез

Принцип метода заключается в предварительном электрофоретическом разделении смеси антигенов. Затем в канавку, идущую вдоль направления движения белков, вносят преципитирующую сыворотку. Аг и Ат диффундируют в гель навстречу друг другу и, взаимодействуя, образуют дугообразные линии преципитации.

Практическое применение РП в геле

•определение неизвестных Аг и Ат в диагностике вирусных и бактериальных инфекционных заболеваний

•определение токсигенных штаммов (в диагностике дифтерии) и др.