Рисунок 1. Экспрессия NLRP3 на S100beta+ протоплазматических астроцитах в зубчатой извилине гиппокампа головного мозга в экспериментальных группах. Двойное иммунофлуоресцентное окрашивание: экспрессия NLRP3 +клеток (красный), S100beta +клеток (зеленый), DAPI-ядра (голубой), стрелки в Merge показывают колоколизацию NL- RP3 с S100beta в зубчатой извилине гиппокампа в экспериментальных группах. Сокращения: GCL - гранулярной слой, SGL - субгранулярный слой
Figure 1. Expression of NLRP3 on S100beta+ protoplasmic astrocytes in the dentate gyrus. NLRP3+ cells (red) and S100beta+ cells (green) in combination with DAPI nuclear staining (blue), Arrows show the colocalization of NLRP3 with S100beta in the dentate gyrus. GCL is for granular layer, SGL is for subgranular layer
Результаты
В ходе анализа двойного иммуногистохимического окрашивания срезов головного мозга выявлено статистически значимое увеличение экспрессии SJOObeta-экспрессирующих клеток (рисунок 1) при введении бета-амилоида в гиппокамп животных. Так, количество клеток в опытной группе с введением бета-амилоида увеличилось до 6,10±0,29 в субгранулярной зоне зубчатой извилины гиппокампа, тогда как у ложно-оперированных животных экспрессия маркера S100beta составила 2,45±0,38 (р<0.0001). Далее в клетках, экспрессирующих S100beta, мы оценили колоколизацию с маркером инфламммасом NLRP3, определив коэффициент корреляции Пирсона и коэффициент перекрытия двух каналов по Manders (Overlap coefficient). Так, в субгранулярной зоне зубчатой извилины гиппокампа мышей после введения PBS коэффициент перекрытия 0,76±0,06, что статистически достоверно не отличалось от показателей у мышей после проведения моделирования амилоид-индуцированной нейродегенерации 0,81±0,02 (р=0.68). Коэффициент Пирсона составил 0,77±0,03 при инъекции бета-амилоида, а при проведении ложной операции с растворителем для бета-амилоида - 0,7±0,08 (р=0.44). Оба показателя указывают на выраженную положительную корреляцию двух маркеров S100beta и NLRP3 в клетках зубчатой извилины обеих групп животных.
Таким образом, амилоид-индуцированная нейродегенерация способствует увеличению экспрессии протоплазматических S100beta астроцитов в субгранулярной зоне зубчатой извилины с интенсивной экспрессией в них инфламмасом. Вместе с тем было показано, что в контрольной группе S100beta клетки также экспрессируют инфламмасомы.
При иммуногистохимическом исследовании CD133+ клеток-предшественниц мы выявили, что экспрессия CD133+ клеток статистически значимо не изменялась при моделировании нейродегенерации (11,6±0,74) и при проведении ложной операции (13,4±0,8) (р=0.07), однако наблюдалась тенденция к снижению экспрессии данного маркера при введении олигомеров бета-амилоида.
Рисунок 2. Экспрессия NLRP3 на CD133+ клетках-предшественниках эндотелиоцитов в зубчатой извилине гиппокампа головного мозга в экспериментальных группах. Двойное иммунофлуоресцентное окрашивание: экспрессия NLRP3+клеток (зеленый), CD133+клеток (красный), Merge изображение показывает колоколизацию NLRP3 с CD133 в зубчатой извилине гиппокампа в экспериментальных группах. Сокращения: GCL - гранулярной слой, SGL - субгранулярный слой. Ядра не представлены на рисунке
Figure 2. Expression of NLRP3 on CD133+ endothelial progenitor cells in the dentate gyrus. NL- RP3+ cells (green) and CD133+ cells (red). GCL is for granular layer, SGL is for subgranu- lar layer
При отсутствии статистически значимых различий в экспрессии СШЗЗ-позитивных клеток-предшественников мы выявили, что CD133+ клетки могут экспрессировать инфламмасомы NLRP3 (рисунок 2). Мы выявили, что при моделировании амилоид-индуцированной нейродегенерации происходит статистически значимое увеличение колокализации этих двух маркеров, что проявляется высоким коэффицентом Пирсона у экспериментальной группы с введением олигомеров бета-амилоида (0,86±0,01) по сравнению с ложно-оперированными животными (0,47±0,07) (р=0.002). Данный факт подтверждают и коэффициенты перекрытия 0,60±0,07 и 0,94±0,01 для амилоид-индуцированной нейродегенерации и группы с введением эквивалентного количества PBS соответственно (р=0.009).
Таким образом, мы отметили, что через 10 дней после инъекции бета-амилоида наблюдаются изменения в субгранулярной зоне зубчатой извилины гиппокампа, которые касаются, прежде всего, увеличения экспрессии протоплазматических S100beta астроцитов повышенной экспрессией в них NLRP3 инфламмасом, но не CD133-позитивных клеток.
Обсуждение
Болезнь Альцгеймера представляет собой прогрессирующее нейродегенеративное заболевание, которое клинически характеризуется прогрессирующей когнитивной дисфункцией, а воспаление играет важную роль в его патогенезе [16].
Все большее количество данных свидетельствует о том, что существует тесная связь между нейровоспалительной реакцией и амилоидогенезом. Было показано, что трансгенные мыши с БА имеют более реактивную глию вокруг бляшек Ав [17], а также, что нейротоксичность Ав может быть усилена микроглией или астроцитами.
Таким образом, при моделировании нейродегенерации мы наблюдаем увеличение числа зрелых астроцитов, экспрессирующих S100be- ta. S100beta является кальций-связывающим белком, который продуцируют астроциты. Кроме того, было показано, что уровень астроцитов, экспрессирующих S100beta, увеличивается при развитии нейродегенерации, а также данный маркер может быть использован в качестве диагностического при болезни Альцгеймера [18]. S100beta экспрессируют преимущественно астроциты, входящие в состав нейроваскулярной единицы головного мозга (т.н. протоплазматические астроциты) [19]. Таким образом, увеличение экспрессии S100beta может свидетельствовать о том, что при экспериментальной болезни Альцгеймера S100 beta-иммунопозитивные (протоплазматические, ассоциированные с нейроваскулярной единицей) астроциты в пределах нейрогенных ниш реагируют на нейротоксическое действие олигомеров бета-амилоида.
За последнее десятилетие было показано, что отложение амилоидав (Ав) в сенильных бляшках сопровождается выраженным хроническим воспалительным ответом [20], что характеризуется высвобождением провоспалительных цитокинов реактивными микроглиальными клетками и, по всей видимости, астроцитами, которые окружают амилоидные отложения. Согласно классической точки зрения, нейровоспаление в патогенезе БА вызывает нейрональную токсичность, приводящую к когнитивным дефицитам [21], но вместе с тем это способствует активации защитных механизмов, поскольку реактивность глиальных клеток увеличивает фагоцитоз и клиренс отложений Ав [22].
При нейродегенерации, сопровождающейся нейровоспалением, экспрессия инфламмасом в основном изучалась на клетках микроглии. Несмотря на то, что большинство исследований посвящено возможному влиянию микроглиального воспаления при БА, недавние исследования показывают, что именно астроцитарное воспаление может играть ключевую роль. Так, были обнаружены маркеры воспаления, такие как цитокины, вокруг бета-амилоидных бляшек, характерных для развития болезни Альцгеймера. Кроме того, было убедительно показано, что при нейровоспалении, сопровождающем развитие болезни Альцгеймера, активируются пути врожденного иммунитета, в том числе Го//-подобные рецепторы и ^ИР3 инфламмасомы. Имеются данные, что протофибриллы бета-амилоида непосредственно способствуют формированию и активации инфламмасом [23,24].
По данным некоторых авторов, созревание некоторых цитокинов, таких как К-1р, осуществляется инфламмасомами в цитозоле микроглии. Фагоцитоз Ав активирует NLRP3 в этих клетках [10], тем самым связывая интернализацию патологических белков с высвобождением провоспалительных цитокинов при нейродегенеративных заболеваниях. Однако до сих пор не было известно, возможна ли экспрессия инфламмасом NLRP3 клетками, которые экспрессируют S100beta при болезни Альцгеймера. Результаты недавних исследований подтверждают, что индукция выраженного воспалительного ответа сопровождается увеличением экспрессии S100beta и выделении цитокинов глиальными клетками при прогрессировании рассеянного склероза [25]. Также при этой патологии увеличение экспрессии S100be- ta ассоциировано с повреждением гематоэнцефалического барьера (ГЭБ) [26]. Дальнейшие исследования необходимы для подтверждения использования этой молекулы не только в качестве молекулы-маркера нейродегенерации, но и повреждения проницаемости ГЭБ при нейродегенерации.
Таким образом, было показано, что развитие воспаления в ткани головного мозга при нейро-токсическом действии бета-амилоида связано с формированием Мл^3-инфламмасом в нейрогенной нише головного мозга, что в конечном итоге может приводить к нарушению процессов синаптогенеза, нейрогенеза и ангиогенеза, ассоциированных с репарацией или реализацией когнитивных функций.
Накоплены убедительные доказательства значимой роли локальных воспалительных процессов в прогрессировании БА. Показано, что активация системы комплемента и его провоспалительные последствия участвуют в патогенезе болезни, а связанные с воспалением цитокины сегодня считаются движущей силой невропатологического каскада прогрессирования БА [1].
Весьма важным является изучение как повышение уровня бета-амилоида в головном мозге влияет на эндотелиальные клетки-предшественники, а это, в свою очередь, на процессы ангиогенеза, структурную целостность ГЭБ и особенности формирования нейровоспаления. Из-за своего стратегического расположения эндотелиальные клетки способны взаимодействовать с другими клетками как в кровотоке, так и в стенке сосуда, в то время как обширная площадь поверхности эндотелия является оптимальным местом для взаимодействия «клетка-клетка» и «клетка-матрикс» [27].
Так было показано, что при церебральной дисфункции, наблюдаемой при нейродегенерации альцгеймеровского типа, механизмы восстановления сосудов и нейронов опосредуются циркулирующими клетками-предшественниками in vivo. Однако являются ли CD133+ клетки-предшественники вовлеченными в патофизиологию БА, до сих пор остается мало изученным. Нами не было зафиксировано достоверного увеличения CD133+ клеток в зубчатой извилине гиппокампа при введении олигомеров бета-амилоида. Литературные данные также остаются на сегодняшний день весьма противоречивыми. Так, в одном исследовании [28] было отмечено увеличение циркулирующих CD133-позитивных клеток в крови пациентов с тяжелой формой деменции по сравнению со здоровыми людьми из группы контроля. Также ранее было показано ступенчатое усиление циркулирующих CD133+ клеток-предшественников у пациентов с БА, которые могут принимать участие в процессах заживления тканей головного мозга в БА, поэтому этот маркер, возможно, может отражать тяжесть течения процесса.
В другом исследовании [18] у пациентов с БА наблюдали снижение CD133-позитивных клеток по сравнению с контрольными субъектами, однако такое наблюдение было статистически незначимым. Полученные результаты свидетельствуют о том, что у пациентов с БА имелась тенденция к снижению количества циркулирующих эндотелиальных клеток-предшественников. Таким образом, можно было предположить, что функция не только зрелых эндотелиальных клеток нарушается у пациентов с болезнью Альцгеймера, но и маркеры эндотелиальных предшественников могут быть новым биомаркером БА.
Еще одно исследование [29] говорит о том, что популяция CD133-позитивных клеток обладает способностью образовывать капиллярные трубки, поэтому возможно использовать данную молекулу для оценки ангиогенного потенциала головного мозга при развитии нейродегенерации.
Тем не менее, наши наблюдения показали, что, несмотря на отсутствие статистически значимых различий в экспрессии CD133- позитивных клеток, мы обнаружили увеличение экспрессии инфламмасом NLRP3 в этих клетках при нейрогенерации, вызванной инъекцией бета-амилоидов. Это в свою очередь может свидетельствовать о том, что функциональная активность этих клеток меняется, реализуя воспалительный фенотип.
Известно, что при воздействии различных раздражителей окружающей среды эндотелиальные клетки подвергаются глубоким изменениям в экспрессии и функции генов, участвующих в многочисленных воспалительных реакциях. В результате эндотелиальные клетки являются мишенью цитокинов, секретируемых другими клетками, а также прямыми генераторами ряда цитокинов вследствие различных факторов и раздражителей, включая гипоксию, окисленные липопротеины, системные/сосудистые инфекции и повреждение сосудистых клеток. Было показано, что среди факторов, влияющих на церебральные эндотелиальные клетки, воздействие Ав вызывает массив провоспалительных реакций с повышенной секрецией различных цитокинов, включая провоспалительные медиаторы К-1 и К-6 [27]. Однако до сих пор до конца не выясненно, каким образом меняется экспрессия инфламмасом в эндотелиальных клетках-предшественниках.
В литературе имеются единичные упоминания о том, что возможно стимулирование ангиогенеза и восстановление функции эндотелиальных клеток путем ингибирования NLRP3 в эндотелиальных клетках-предшественниках в стрептозоциновой модели сахарного диабета [30]. Известно, что болезнь Альцгеймера также сопровождается развитием локальной инсулинорезистентности, а нарушение передачи сигналов инсулина, лежащего в основе патогенеза сахарного диабета 2 типа, способствует генерации бета-амилоида в головном мозге животных за счет активации гамма-секретазы и накопления аутофагосом [31].
Следует отметить, что при исследовании микрососудов при болезни Альцгеймера наблюдалось устойчивое повышение уровня воспалительных медиаторов. По сравнению с микрососудами, полученными от контрольной группы, при нейродегенерации были обнаружены более высокие уровни ряда воспалительных факторов, включая оксид азота, тромбин, Т^-а, трансформирующий фактор роста в, №-1р, К-6, К-8, и матриксных металлопротеиназ [32]. В настоящее время одной из наиболее вероятных теорий развития церебральной амилоидной ангиопатии и опосредованной олигомерами бета-амилоида клеточной гибели, являются специфические механизмы, вызванные различными воспалительными медиаторами. Одним из наиболее изученных механизмов является К-1 -опосредованный путь, способный усугублять нейропатологические изменения, нейронный стресс и нейровоспаление. Показано, что этот механизм, опосредуемый К-1, вызывает А-индуцированный нейронный апоптоз посредством активации ^кВ пути [33].