Провоспалительный фенотип периваскулярной астроглии и СР133+ клеток-предшественников эндотелиоцитов при моделировании болезни Альцгеймера у мышей черных
А.И. КОМЛЕВА, Ю.К. ГОРИНА, Я.В. ЛОПАТИНА
О.Л. ПАЩЕНКО, С.И. САЛМИНА
1. НИИ молекулярной медицины и патобиохимии, ФГБОУ ВО «Красноярский государственный медицинский университет им. проф. В.Ф. Войно-Ясенецкого» Министерства здравоохранения Российской Федерации, Красноярск, Россия
2 ФГБОУ ВО «Красноярский государственный медицинский университет имени профессора В.Ф. Войно-Ясенецкого» Министерства здравоохранения Российской Федерации, Красноярск, Россия
3 КГБУЗ «Красноярская межрайонная клиническая больница №20 им. И.С. Берзона», Красноярск, Россия
Резюме
Цель. Изучить экспрессию NLRP3 в периваскулярной астроглии и CD133+ эндотелиальных клетках-предшественниках при амилоид-индуцированной нейродегенерации.
Материалы и методы. Эксперименты выполнены на мышах мужского пола линии CD1 (4 месяцев, весом 25-30 г). Мышам экспериментальной группы введен Api-42 в гиппокамп головного мозга. Через 10 дней после инъекции провели иммуногистохимическую оценку экспрессии NLRP3 инфламмасом в S100beta и CD133+ клетках методом визуализации конфокальной микроскопии. Определили коэффициент корреляции Пирсона и коэффициент перекрытия по Manders (overlap coefficient).
Результаты. Определено увеличение экспрессии S100beta-позитивных клеток при введении бета-амилоида в гиппокамп животных. При оценивании колокализации S100beta/NL-RP3. Выявлена выраженная положительная корреляция двух маркеров S100beta и ЖЕР3 в клетках зубчатой извилины обеих групп животных. При иммуногистохимическом исследовании CD133+ клеток-предшественниц не зафиксировано статистически значимых отличий при моделировании нейродегенерации и при проведении ложной операции, однако наблюдалась тенденция к снижению экспрессии данного маркера при введении олигомеров бета-амилоида. Тем не менее, при моделировании амилоид-индуцированной нейродегенерации отмечается статистически значимое увеличение колокализации CD133/NLRP3.
Заключение. При моделировании болезни Альцгеймера отмечается эффект активации глии с экспрессией S100beta. Увеличение экспрессии S100beta может свидетельствовать о том, что при экспериментальной болезни Альцгеймера S100beta-иммунопозитивные (протоплазматические, ассоциированные с нейроваскулярной единицей) астроциты в пределах нейрогенных ниш реагируют на нейротоксическое действие олигомеров бета-амилоида. По данным иммуногистохимического анализа было показано, что развитие воспаления в ткани головного мозга при нейротоксическом действии бета-амилоида связано с формированием ЖЯРЗ-инфламмасом в нейрогенной нише головного мозга, что в конечном итоге может приводить к нарушению процессов синапто-генеза, нейрогенеза и ангиогенеза, ассоциированных с репарацией или реализацией когнитивных функций. Экспрессия инфламмасом
NLRР3 в CD133+ клетках-предшественниках эндотелиальных клеток увеличивается при моделировании болезни Альцгеймера. Такой про- воспалительный фенотип клеток, по всей видимости, необходим для формирования сложного самоактивирующегося порочного круга, способного приводить к дальнейшей дисфункции нейроваскулярной единицы.
Ключевые слова: периваскулярная астроглия, инфламмасомы NLRР3, клетки-предшественники эндотелиоцитов, моделирование болезни Альцгеймера у мышей.
Abstract
PRO-INFLAMMATORY PHENOTYPE OF PERIVASCULAR ASTROCYTES AND CD133+ ENDOTHELIAL PROGENITOR CELLS IN MURINE MODEL OF ALZHEIMER'S DISEASE
ANATOLIY I. CHERNYKH1'3, YULIYA K. KOMLEVA1'2, YANA V. GORINA1'2, OLGA L. LOPATINA1'2 SVETLANA I. PASCHENKO2, ALLA B. SALMINA1'2
Aim. To study the expression of NLRP3 in perivascular astrocytes and CD133+ endothelial progenitor cells in mice with amyloid-induced neurodegeneration.
Materials and Methods. Ten days following intrahippocampal injection of Afl1-42, male CD1 mice (4 months, weight 25-30 g) were sacrificed with the further immunohistochemical examination of the NLRP3 expression in S100 beta + and CD133+ cells using confocal microscopy.
Results. We detected an increased number of S100beta + cells upon the administration of P-amy- loid to the hippocampus. Moreover, a strong colocal ization of S100beta and NLRP3 in the dentate gyrus of both groups was revealed indicative of neuroinflammation. CD133 immunostaining did not identify any differences in CD133+ cells between mice with Alzheimer's disease and sham-treated mice, yet there was a notable reduction in CD133+ cell count after intrahippocampal injection of P-amyloid.
Conclusion. Neuroinflammation induced by P-amyloid is associated with the formation of NL- RP3 inflammasomes and decreased neovascularization capacity.
Keywords: perivascular astrocytes, NLRP3 inflammasomes, endothelial progenitor cells, Alzheimer's disease.
Введение
фенотип периваскулярный астроглия альцгеймер
Болезнь Альцгеймера (БА) является наиболее распространенной причиной деменции у пожилых людей, характеризуется изменением когнитивных функций, а также появлением в мозге сенильных бляшек, нейрофибриллярных клубков и потерей нейронов [1].
Существенные генетические, биохимические и in vivo данные свидетельствуют о том, что прогрессирующее накопление амилоида-Р (AP) играет центральную роль в патогенезе болезни Альцгеймера. Исторически сложилось так, что именно формирование амилоидных бляшек в паренхиме мозга было центральным пунктом, тем не менее, в настоящее время начинает проявляться все больше данных о роли церебральной амилоидной ангиопатии, которая сопровождает отложения более чем в 80% случаев БА [2].
Церебральная амилоидная ангиопатия ассоциируется с микрососудистыми изменениями, ишемическими поражениями, микро- и макро-кровоизлияниями и деменцией, посте
пенно влияя на мозговой кровоток, изменяя проницаемость гематоэнцефалического барьера, препятствуя механизмам очищения мозга и вызывая каскад провоспалительных и метаболических событий, которые нарушают целостность нейроваскулярной единицы. Новые данные свидетельствуют о вкладе Ар в индукцию дисфункции эндотелиальных клеток головного мозга. Недавно обнаруженное взаимодействие олигомерных форм Ар с рецепторами клеточной гибели, которое опосредует взаимодействие митохондриальных путей и последовательную активацию множественных каспаз, вызывая каскад механизмов клеточной гибели, открывает возможность изучения новых подходов к сохранению целостности нейроваскулярной единицы [3].
В большинстве исследований, связанных с изучением механизмов, стимулирующих воспаление при нейродегенерации, основное внимание уделяется роли микроглиальных клеток, в то время как немного известно о вкладе клеток стенок сосудов, несмотря на мощный воспалительныи потенциал как эндотелиальных клеток, так и их предшественников. Вместе с тем, эти клетки вовлечены в формирование локального воспаления, способны секретировать широкии спектр медиаторов, начиная от провоспалительных и регуляторных интерлейкинов (например, IL-1, 6, 8, 10), колоний-, грану- лоцитарных и макрофагально-стимулирующих факторов и хемокинов, важных медиаторов регуляции цитокинов, таких как TNF-a и IFG-y [4].
Кроме того, несмотря на многочисленные успехи в понимании патогенеза болезни Альцгеймера, мало известно о роли глиальных клеток при хронической нейродегенерации [5]. Также известно, что микроглия участвует в поддержании гомеостаза взрослого и развивающегося мозга, обеспечивая локальный иммунный ответ. Вместе с тем, астроциты - это не менее активные участники процессов, связанных с развитием локального воспаления и иммунного ответа в головном мозге, что становится все более очевидным в последние годы [6].
Микроглия и астроциты все чаще распознаются как клетки, имеющие ключевые иммунологические функции в головном мозге, и их роль в развитии БА была недавно исследована [7]. Более того, микроглия и астроциты экспрессируют to/Z-подобные рецепторы (TLR) и опосредуют ответы на врожденные иммунные триггеры, выделяя провоспалительные молекулы [8].
Одной из таких молекул, способной контролировать активность каспазы-1 и участвовать в созревании ILlbeta, является цитозольный мультипротеиновый комплекс, называемый «инфламмасома». Инфламмасома представляет собой олигомерный белковый комплекс, организованный как трехсторонняя структура: (1) сенсор цитозольной опасности семейства NLR (NOD-подобных рецепторов), такой как NALP3 (NACHT, LRR и PYD-содержащий белок 3), также известный как NLRP3 (NOD-подобное рецепторное семейство, пириновый домен, содержащий 3) и NALP1 или IPAF (фактор активации криопротеазы), (2) протеолитическая эффекторная каспаза-1 и (3) ASC (ассоциированный с апоптозом спекподобный белок, содержащий CARD домен), адаптерный белок, необходимый для сборки NLR и стабилизации комплексов каспазы-1/NLR [9].
Недавно было продемонстрировано, что инфламмасомы, экспрессирующие NLRP3, могут быть активированы бета-амилоидом in vitro, что приводит к воспалению и повреждению тканей [10].
К числу наименее изученных молекулярных событий при нейровоспалении следует отнести процесс формирования инфламмасом при действии олигомеров Ав в клетках глиальной природы и эндотелиальных клетках предшественниках [11],
Цель исследования. Изучить экспрессию NLRP3 в периваскулярной астроглии и CD133+ эндотелиальных клетках-предшественниках при амилоид-индуцированной нейродегенерации.
Материалы и методы
Животные. Эксперименты проводили с использованием самцов мышей линии CD1 (4 месяцев, весом 25-30 г). Животных содержали по 4-5 особей в клетке при температуре на уровне 21-22°C со свободным доступом к воде и корму и регулярном световом цикле 12 ч день/12 ч ночь. Все манипуляции выполнялись во время светлой фазы дня. В ходе эксперимента были предприняты все усилия для сведения к минимуму страданий животных и сокращения их числа. Исследования на животных проводились в соответствии с соблюдением принципов гуманности, изложенных в Директиве Европейского Парламента и Совета Европейского союза (2010/63/ЕС) и с разрешения биоэтической комиссии при КрасГМУ им. проф. В.Ф. Войно-Ясенецкого.
Дизайн эксперимента
Животных случайным образом поделили на две группы (n = 8 в группе: 1) ложно-оперированные животные с введением фосфатно-буферного солевого раствора (PBS); 2) экспериментальная группа с введением Afll-42. Через 10 дней после интрагиппокампальной инъекции проводили транскардиальную перфузию после эвтаназии с забором головного мозга [12].
Хирургическое моделирование болезни Альцгеймера
Api-42 (Sigma-Aldrich) был растворен в стерильном 0,1 М PBS (рН 7,4) и получен раствор в концентрации 50uM. Аликвоты хранили при -200C. Api-42 агрегировали путем инкубации при 37°С в течение 7 дней перед введением [12,13]. Полученные олигомеры Api-42 вводили интрагиппокампально в СА1 зону с двух сторон с помощью микрошприца (Hamilton), как описано ранее [12]. А именно, мышь анестезировали внутрибрюшинной инъекцией хлоралгидрата (400 мг/кг) и убеждались в отсутствии реакции на боль, а также роговичного рефлекса. Затем мышь помещали в стереотаксический аппарат (Neurostar, Germany) и делали оперативный доступ. После обнаружения костных ориентиров рассчитывались координаты введения для каждой мыши в соответствии с индивидуальным коэффициентом согласно стереотаксическому атласу мозга мыши [14]. Afi1-42 вводили билатерально в СА1 зону гиппокампа. Объем инъекции 1 мкл Л^1-42 для экспериментальной группы или 1 мкл фосфатно-солевого буфера (PBS) для ложно-оперированных животных осуществляли постепенно (1 мкл/мин). Подтверждение наличия бета-олигомеров осуществили окраской Тиофлавином S. После инъекции олигомеров амилоида в ткани головного мозга наблюдались флуоресцирующие амилоидные включения зеленого цвета.
Двойное иммуногистохимическое окрашивание
Мозг фиксировали в 4% нейтральном забу- ференном формалине в течение ночи, после чего погружали в 20% раствор сахарозы. Изготавливали срезы 50 мкм с помощью вибратома (Thermo Scientific). Свободно плавающие срезы мозга блокировали в PBS, содержащем 10% нормальной козьей сыворотки (Sigma), 2% бычьего сывороточного альбумина (BSA) (Sigma), 0,2% Triton X-100 (Sigma) и 0,1% азида натрия (Sigma) в течение 1 часа при комнатной температуре. Для оценки экспрессии NLRP3 на SlOObeta-позитивных клетках срезы инкубировали в течение ночи в растворе первичных антител 1:1000 с антителами против S100beta (Abcam, ab41548) и анти NLRP3 антителами (Abcam, ab4207); для определения колокализации CD133 и NLRP3 использовали раствор первичных антител 1:1000, содержащий анти-CD133 (Abcam, ab16518) и анти NLRP3 антитела (Abcam, ab4207).
После инкубации с первичными антителами срезы промывали в PBS и затем инкубировали с вторичными антителами Alexa-конъюгированными (1:1000) в течение 2 ч при комнатной температуре. После промывки срезы укладывали на предметные стекла и добавляли монтирующую жидкость (FluoroMount, Invitrogen). Изображения были сделаны с объективом 60 х на конфокальном флуоресцентном микроскопе (Olympus FluoView) и обрабатывались с использованием программного обеспечения Olympus FluoView software (Ver.4.0a).
Подсчет колокализации экспрессии маркеров
В срезах головного мозга определяли процент колоколизации с NLRP3 в клетках астроглиальной природы, экспрессирующих S100be- ta, а также экспрессию NLRP3 в CD133- позитивных клетках в субгранулярном слое зубчатой извилины гиппокампа. Оценивали семь полей зрения.
Были определены следующие коэффициенты: коэффициент корреляции Пирсона и коэффициент перекрытия по Manders (overlap coefficient). Коэффициент корреляции Пирсона (Pearson's correlation coefficient, Коэффициент Пирсона) является одной из стандартных мер при определении колоколизации изображений. Он отражает средние интенсивности каналов каждого маркера. Его значения варьируются от -1,0 до 1,0, где 0 не указывает на значительную корреляцию, а -1,0 свидетельствует о полной отрицательной корреляции.
Коэффициент перекрытия по Manders указывает на перекрытие сигналов и, таким образом, отражает истинную степень колокализации [15].
Статистический анализ
Статистический анализ полученных результатов включал методы описательной статистики с использованием программы Graph- Pad Prism 6,0 (GraphPad Software, La Jolla, CA, USA). В пределах каждой выборки определяли среднее арифметическое и ошибку среднего. Сравнение средних осуществляли с помощью непараметрического U критерия Манна-Уитни при уровне значимости р < 0,05. Все результаты представлены в виде M±m, где М - среднее значение, m - ошибка среднего, p - уровень значимости.