Гродненский государственный медицинский университет
Полиморфизм генов фолатного цикла и степень тяжести расстройств аутистического спектра
Бизюкевич С.В.
Гродно, Беларусь
Резюме
Целью данной работы является изучение полиморфизмов генов фолатного цикла и распределение полиморфных вариантов генов в зависимости от степени тяжести расстройств аутистического спектра. В исследование включено 102 пациента с расстройствами аутистического спектра в возрасте от 2 до 10 лет.
Выявление мутаций генов фолатного цикла MTHFR С677Т, MTHFR А1298С, MTRR A66G, MTR A2756G проводили методом молекулярно-генетического анализа, с использованием диагностических наборов «SNP-Скрин» и «ДНК-Экстран».
Для количественной оценки степени выраженности аутистических проявлений использовался «План диагностического обследования при аутизме» (ADOS-2).
В результате исследования отмечено, что у исследуемой группы детей в 98% случаев выявлен полиморфизм генов фолатного цикла.
Частота распределения полиморфных вариантов преобладала в гене MTRR A66G 78,4% (49% AG; 29,4% G/G) и в гене MTHFR C677T 66,6% (44% C/T; 22,5% T/T). В 22,5% случаев имел место полиморфизм в гомозиготном состоянии Т/Т, гена MTHFR 677.
Полиморфизм гена MTHFR A1298C составил 52% (40% A/C; 12% C/C), а полиморфизм гена MTR A2756G - 51% случаев (35,2% A/G; 15,6% G/G). По методике ADOS-2 в 45 случаях (44%) выявлена умеренная степень выраженности симптомов аутизма, а в 34% случаев (35 детей) - тяжелая, у 22% детей - легкая степень выраженности клинических признаков аутизма.
Установлено статистически достоверное распределение гетерозиготных и гомозиготных аллельных вариантов генов фолатного цикла в зависимости от степени тяжести расстройств аутистического спектра (p<0,05).
Гетерозиготные полиморфизмы генов фолатного цикла чаще всего встречаются при умеренной степени тяжести РАС, а наибольшее количество гомозиготных полиморфизмов генов фолатного цикла распределено при тяжелой степени выраженности клинических признаков аутизма.
Ключевые слова: полиморфизм генов фолатного цикла, степень тяжести расстройств аутистического спектра, гомозиготы, гетерозиготы, гены.
Abstract
Polymorphism of Folate Cycle Genes and Severity of Autism Spectrum Disorders
Biziukevich S.Grodno State Medical University, Grodno, Belarus
The purpose of this work is to study the polymorphisms of folate cycle genes and the distribution of polymorphic variants of genes depending on the severity of autism spectrum disorders.
The study included 102 patients with autism spectrum disorders aged from 2 to 10 years.
Detection of mutations in the folate cycle genes MTHFR C677T, MTHFR A1298C, MTRR A66G, MTR A2756G was performed with molecular genetic analysis using the diagnostic kits "SNP-Screen" and "DNA- Extran". To quantify the severity of autism spectrum disorders, the Autism Diagnostic Observation Schedule (ADOS-2) was used.
As a result of the study, it was noted that the study group of children in 98% of cases revealed polymorphism of the folate cycle genes.
The frequency of distribution of polymorphic variants prevailed in the MTRR A66G gene 78,4% (49% AG; 29,4% G/G) and in the MTHFR C677T gene 66,6% (44% C/T; 22,5% T/T).
In 22,5% of cases, there was a polymorphism in the homozygous state of T/T, the gene MTHFR 677.
The gene MTHFR A1298C polymorphism was 52 % (40% A/C; 12% C/C), and the gene MTR A2756G polymorphism was observed in 51% of cases (35,2% A/G; 15.6% G/G).
According to the ADOS-2 method, in 45 cases (44%), moderate severity of autism symptoms was detected, in 34% of cases (35 children) - severe, in 22% of children, light severity of clinical signs of autism was revealed.
A statistically reliable distribution of heterozygous and homozygous allelic variants of folate cycle genes was revealed depending on the severity of autism spectrum disorders (p<0.05). Heterozygous polymorphisms of folate cycle genes are most often found in moderate severity of ASD, and the largest number of homozygous polymorphisms of folate cycle genes is distributed in severe clinical signs of autism.
Keywords: polymorphism of folate cycle genes, severity of autism spectrum disorders, homozygotes, heterozygotes, genes.
Введение
В последние годы наблюдается увеличение частоты встречаемости расстройств аутистического спектра (РАС) среди детского населения различных стран, что находит отражение в научных публикациях и официальной медицинской статистике.
Одной их современных теорий патогенеза расстройств аутистического спектра является генетический полиморфизм ферментов фолатного цикла.
Фолатный цикл - каскадный процесс, в котором участвуют ферменты: метилентетрагидрофолатредуктаза (MTHFR), метионинсинтазаре- дуктаза (MTRR) и метионинсинтаза (MTR).
Ключевым этапом в данном процессе является синтез метионина из гомоцистеина. Нарушения фолатного цикла приводят к накоплению гомоцистеина в клетках и повышению общего уровня гомоцистеина в плазме, так называемая гипергомоцистеинемия.
Многими научными исследованиями доказано, что гомоцистеин обладает токсическим, атерогенным и тромбофилическим действием, приводит к риску развития многих патологических состояний, таких как осложнения беременности [1, 2], перинатальная смерть, рождение детей с врожденными пороками развития [2, 3], сердечнососудистые расстройства [4], онкологические заболевания [5], а также повышает риск развития психических расстройств [6-8], в том числе и аутизма [9, 10].
Установлено, что главными причинами нарушения фолатного цикла являются генетические полиморфизмы ферментов фолатного цикла, дефицит витаминов: фолиевой кислоты, витаминов пиридоксина (В6) и цианкобаламина (В12), участвующих в обмене фолатов [9].
Известно, что полиморфизмы генов фолатного цикла выявляются в гетерозиготном и гомозиготном состоянии. Гомозиготные, аллельные варианты генов фолатного цикла являются наиболее неблагоприятным вариантом носительства и свидетельствуют о снижении активности фермента на 65-70% [9, 11]. В связи с этим фермент, который кодируется гомозиготным полиморфным вариантом, не выполняет свою функцию в фолатном цикле и приводит к значимым метаболическим нарушениям в организме человека. Гетерозиготные полиморфные варианты генов снижают активность ферментов на 15-35% и способствуют развитию менее значимых метаболических нарушений [9, 11]. Клиническая выраженность метаболических нарушений утяжеляется по мере накопления генетических мутаций. полиморфизм фолатный ген аутизм
Наиболее изученными полиморфизмами гена MTHFR являются замены нуклеотидной последовательности в кодоне 677 и в кодоне 1298. Полиморфизм гена MTHFR 677 связан с заменой нуклеотида цитозина (С) в 677 на тимин (Т). Частота для гомозиготного полиморфного варианта Т/Т в различных популяциях здоровых людей составляет 4-16%, для гетерозиготного С/Т - 38-67%. В кодоне 1298 гена MTHFR происходит замена аденина (А) на цитозин (С).
Частота встречаемости полиморфизма гена MTHFRA 1298C в гомозиготном варианте С/С составляет 3-13%, в гетерозиготном А/С - 45-55%. В генах MTRR и MTR известны полиморфизмы, обусловленные заменой аденина (А) на гуанозин (G).
Полиморфизм гена MTRR A66G в гомозиготном варианте встречается с частотой 15-25%, в гетерозиготном варианте - 40-50%. Ген MTR A2756G в гомозиготном варианте встречается с частотой 20-30%, в гетерозиготном - 43-52% [12]. В белорусской популяции имеется исследование (n=482) по распределению полиморфных вариантов у здоровых людей в гене MTHFR 677: С/С - 41,1%, С/Т- 53,5%, Т/Т - 5,4% [13].
Украинские ученые доказали, что наличие полиморфизмов генов фолатного цикла и повышенного уровня гомоцистеина в плазме крови является недостаточным условием для развития РАС [9, 14, 15]. Они установили, что полиморфизм генов фолатного цикла приводит к развитию первичного иммунодефицита у 90% детей с РАС.
Основой такого иммунодефицита является аномально малое количество натуральных киллеров (NK) и натуральных Т-киллерных лимфоцитов (NKT) [14, 15]. Такая особенность иммунодефицита у детей с РАС ассоциирована с повышенной склонностью к развитию аутоиммунных осложнений [15, 16] и гиперчувствительности замедленного типа [15-17], к продукции аномально повышенного уровня аутоантител к мозговым антигенам. Также авторы утверждают, что повреждение головного мозга при генетическом полиморфизме ферментов фолатного цикла происходит разными путями: в результате развития аутоиммунной реакции к мозговым антигенам с формированием лейкоэнцефалопатии разной степени тяжести [14, 15, 17] или нарушения внутриутробного развития нервной системы с возникновением нейроденегерации, включая височный медианный склероз [14, 15, 17].
Исследования украинских ученых показали, что при наличии гомозиготной мутации в гене не всегда снижается активность определенной функции фермента. Но именно полиморфизмы генов фолатного цикла являются маркерами уязвимости, которые под влиянием триггерных неблагоприятных факторов могут запускать патологические механизмы развития РАС [9, 14-17].
На сегодняшний день в научных работах многих исследователей показано, что мутации или структурные изменения в любом из генов могут не только значительно увеличить риск развития РАС, но и оказать влияние на характер клинических признаков у детей с аутизмом [9, 18].
Ученые кафедры медицинской биологии университета Erciyes (Турция) в своих исследованиях продемонстрировали взаимосвязь между гомозиготным вариантом гена MTHFR 677 (T/T) и клиническими признаками расстройств аутистического спектра.
Авторы установили, что у детей с РАС, у которых выявлялся гомозиготный вариант гена MTHFR 677 (T/T), обнаруживали больше поведенческих проблем, чем тех, у которых отмечался (С/С) вариант гена MTHFR 677. В клинической картине у детей с расстройствами аутистического спектра, имеющих гомозиготный вариант гена MTHFR 677 (T/T), отмечались сложные стереотипные движения, выраженная аутоагрессия и разрушающее поведение [19].
Несмотря на имеющиеся исследования, в которых обсуждается участие генетического полиморфизма ферментов фолатного цикла в развитии РАС, публикаций, направленных на изучение полиморфизмов генов фолатного цикла и распределение полиморфных вариантов генов в зависимости от степени тяжести расстройств аутистического спектра, в доступной литературе найти не удалось.
Цель исследования: Изучить полиморфизм генов фолатного цикла и распределение полиморфных вариантов генов в зависимости от степени тяжести РАС.
Материалы и методы
Исследование выполнено с участием 102 человек, проходивших стационарное обследование и лечение в детском отделении УЗ «ГОКЦ «Психиатрия-наркология» за период с сентября 2017 по февраль 2018 г. Из них мальчики составили 84% (86 человек), девочки - 16% (16 человек). Средний возраст мальчиков составил 5,4±1,62 года, девочек - 5,0±1,86 года.
Выборка формировалась методом направленного отбора в соответствии со следующими критериями: письменное информированное согласие родителя или законного представителя пациента на участие в исследовании, наличие диагноза расстройств аутистического спектра (F84) в соответствии с исследовательскими диагностическими критериями
Международной классификации болезней 10-го пересмотра, женский, мужской пол, возраст 2-10 лет. Критерии исключения составили: сопутствующая острая и хроническая соматическая патология, врожденные пороки и дефекты физического развития, отказ от участия в исследовании.
Выявление мутаций или полиморфизмов генов фолатного цикла MTHFR С677Т и А1298С, MTRR A66G, MTR A2756G осуществляли методом полимеразной цепной реакции, включающей в себя экстракцию ДНК из 5 мл образцов периферической крови, с детекцией продукта амплификации в режиме реального времени (амплификатор «Rotor- Gene 6000/Q»). Использовались диагностические наборы «SNP-Скрин» и «ДНК-Экстран» (производство «Синтол», Российская Федерация) в молекулярно-генетической лаборатории УО «Гродненский государственный медицинский университет».
Статистическую обработку фактического материала выполняли с применением пакета прикладных программ Statistica 10.0. С учетом ограниченной выборки пациентов использовался метод непараметрической статистики х2 Пирсона. Описание количественных признаков выполнено с помощью средней арифметической и стандартного отклонения. Различие сравниваемых величин считали статистически значимым при p<0,05.
Для количественной оценки степени выраженности аутистических проявлений использовался «План диагностического обследования при аутизме» (ADOS-2) (перевод на русский язык и адаптация А. Сорокина, Е. Давыдовой, К. Салимовой при участии Е. Пшеничной; под общей редакцией Александра Сорокина, 2016 г. Giunti OS Organizzazioni Speciali) [20]. Это стандартизированная методика, включающая в себя структурированные виды деятельности и игровые материалы, позволяющие создать ситуации, в которых могут проявиться формы поведения, важные для диагностики расстройств аутистического спектра. ADOS-2 содержит пять модулей, каждый из которых предлагает стандартные виды заданий.
Для каждого из модулей предусмотрен свой бланк, обеспечивающий фиксацию результатов наблюдения, кодирование, шифровку и диагностическое заключение в рамках данного модуля. Выбор модуля происходит в зависимости от возраста ребенка или от уровня владения экспрессивной речью.
Обследование длится 40-60 минут, и отмеченные особенности фиксируются интервьюером, кодируются, а затем переводятся в шифры (0, 1,2, 3, 4) в соответствии со степенью выраженности нарушений в каждом пункте шифровки.
Шифровка ADOS-2 включает пункты, описывающие формы поведения пяти групп: коммуникацию, социальное взаимодействие, игровую деятельность, стереотипные и повторяющиеся формы поведения и другие особенности поведения ребенка. Согласно полученным результатам в процессе исследования можно отнести исследуемого ребенка к одной из следующих диагностических групп: вне спектра аутизма, спектр аутизма и аутизм, а также определить степень выраженности аутистических симптомов: минимальная, низкая (легкая), умеренная и высокая [20].
Критериями исключения для применения ADOS-2 являются патологии слуха, зрения, уровень умственного развития ребенка не соответствующий возрасту 12 месяцев, моторные нарушения, при которых ребенок не способен самостоятельно передвигаться. Применение метода ADOS-2 требует от специалиста профессионального обучения [20].
Исследование проведено в соответствии с принципами клинической биоэтики. Конфликт интересов отсутствует.