Дипломная (вкр): Отъёмно–доливное культивирование микроорганизмов – продуцентов
Среды, содержащие мелассу или гидролизаты растительных отходов, стерилизуют в более мягких условиях (115 - 120°С, 18 - 20 мин), после чего их смешивают с мучным затором.
Для нормального проведения процесса ацетоно-бутилового брожения важно, чтобы в среде имелись в достаточном количестве белки, как это имеет место в мучных заторах.
.3 Поддержание культуры бактерий и подготовка инокулята
Для выращивания чистой культуры С. acetobutylicum пользуются запасом спор бактерии, заготовляемым обычно на шестимесячный (и более) период работы завода.
Заготовку спор проводят на 6 %-ном заторе кукурузной или ржаной муки путем массового высева. Для этого около 100 пробирок со свежим стерильным затором засевают культурой бактерии и весь цикл брожения, заканчивающийся образованием спор, проводят при 37°С. Готовить споры можно и способом разлива. Для каждой новой заготовки используют споры, полученные из культур, давших в производстве наилучшие результаты брожения. Первая половина брожения проводится в одном большом стеклянном сосуде, из которого бражка разливается затем в стерильные пробирки, в которых процесс заканчивается образованием спор. Пробирки со спорами запаивают на газовой горелке и ставят в термостат. Через 48 - 60 ч бродильные газы спускают, пробирки вновь запаивают и хранят при комнатной температуре. После двухмесячного хранения партия спор подвергается проверке путем пробного брожения. Удовлетворяющие техническим условиям споры признаются пригодными для производства и на них составляют паспорт.
Приготовление требуемого количества чистой культуры бактерий для производства состоит из ряда последовательных пересевов, которые ведутся во все увеличивающихся объемах затора. Разведение культуры начинается с посева спорами в аппарате чистой культуры (АЧК) объемом 10 л. Через 28 ч брожения содержимое АЧК стерильно передается в большой инокулятор (БИН) на 3,5 м3 затора. Стерильный затор для БИН берут непосредственно с производства в горячем состоянии, охлаждают его в БИНе или в холодильнике. Из инокулятора культура бактерий передается в ферментатор-активатор производственной батареи с соблюдением условий стерильности.
Для процесса непрерывного ацетоно-бутилового брожения предложена дополнительная стадия. Это аппарат чистой производственной культуры (АЧПК), емкостью 200 м3, который засевается из БИНа, а спустя 10 - 12 ч брожения вся культура из него переводится в первый ферментатор производственной батареи и сразу начинается ее загрузка затором.
.4 Брожение
Для понимания специфики ацетоно-бутилового брожения полезно вначале рассмотреть закономерности периодического процесса, хотя в промышленности оно давно ведется в основном полунепрерывным и непрерывным методами. Уже в первые часы после инокулирования затора активной культурой бактерий наблюдается брожение, заметное по пузырькам газа, поднимающихся к поверхности среды. Газовыделение достигает максимума обычно через 24 - 26 ч, спадая к концу брожения. В период максимального газовыделения происходит характерное расслоение субстрата - на поверхность поднимается рыхлый слизистый слой, в нижнем слое остается мутноватая опалесцирующая жидкость. Вся среда приобретает желтоватую окраску. Это явление в производстве именуется "подъемом" бражки и характеризуется как один из признаков нормального брожения. К концу брожения поднявшаяся твердая часть субстрата оседает на дно. Наряду с газовыделением, характерным для ацетоно-бутилового брожения, является форма кривой титруемой кислотности. Развитие бактерий характеризуется быстрым нарастанием титруемой кислотности, достигающей максимума (4,0 - 4,6 мл 0,1 н NaOH на 10 мл бражки) к 12 - 16 ч брожения, и затем резко снижающегося к 24 - 25-му часу, после чего снова происходит небольшой подъем кислотности к концу брожения. В процесс повышения кислотности рН среды снижается с 6,0 до 4,1 - 4,2 и остается на этом уровне с небольшими колебаниями.
Образование ацетона и спиртов начинается примерно с 6-го часа брожения, но наиболее интенсивно происходит после перелома кривой кислотности. В ацетон и спирты превращается 33 - 35% углеводов и в конечной бражке содержится около 2% растворителей.
Полунепрерывный метод брожения в ацетоно-бутиловом производстве, известный под названием батарейного, имеет ряд преимуществ по сравнению с периодическим и прочно укоренился в нашей промышленности. Батарея состоит из 6 - 8 ферментаторов, последовательно соединенных переточными трубами. Головной из них - активатор, засевают культурой из инокулятора и после перелома кривой кислотности (примерно через 12 ч) начинают загружать мучным затором. Через активатор заполняется вся батарея. Разгрузка батареи (передача бражки на ректификацию) производится с последнего - хвостового ферментатора; после стерилизации он становится активатором следующей батареи, состоящей из тех же ферментаторов, но загружаемых в обратном направлении.
Непрерывное брожение облегчило замену больших количеств муки (до 70%) более дешевым сырьем: свеклосахарной патокой (мелассой) и гидролизатами отходов растительного сырья.
Для первой фазы брожения целесообразнее применять
мучной затор, что обеспечивает быстрый рост бактерий и образование ферментов
для синтеза растворителей.
Рисунок 3 - Двухпоточная схема непрерывного
ацетоно-бутилового брожения. Мучной затор: 1 - заторный чаи; 2 -
подогреватель ангора; 3 - ловушка; 4 - насос; 5 - варочная колонна; 6 -
выдерживатель; 7 -ннросспаратор; 8 - насос; 9 - холодильник; Паточно-гидролизатпый
затор: 10 - заторный чан; 11 - лопушка; 12 - насос; 13 - подогревательная
колонки; 14 - выдерживатели; 15 - паросепаратор; 16 - насос; 17 - холодильник;
18 - АЧПК; 19, 20 - первый и второй ферментаторы батареи; 21-23 - ферментаторы
батареи; 24 - насос для подачи бражки на ректификацию.
Мелассу и гидролизаты вводят при переходе брожения во вторую фазу.
Разработана двухпоточная схема непрерывного брожения (рисунок 3). При этой схеме мучной и паточно-гидролизатный мучной затор направляется в первый (головной) ферментатор батареи, а также на разведение чистой культуры в инокулятор и АЧК; мелассный затор - во второй ферментатор, где происходит переход во вторую фазу брожения.
В результате внедрения способа непрерывного брожения на Нарткалинском ацетоновом заводе при переработке смешанных заторов (с заменой 70% муки) по сравнению с прежней полунепрерывной схемой брожения мучных заторов производительность заметно возрастала. Весь процесс ацетоно-бутилового брожения, будь то периодический, полунепрерывный или непрерывный, ведется в строго стерильных условиях, в герметически закрытых ферментаторах под небольшим избыточным давлением (0,4·106 - 0,8·105 Па), создаваемым газами брожения. Выделяемые при брожении газы удаляются через специальные коммуникации. Газы выбрасываются в атмосферу или направляются на переработку (например, в жидкую углекислоту или сухой лед).
.5 Инфицирование в условиях ацетоно-бутилового брожения
Ведение ацетоно-бутилового брожения с применением чистой культуры бактерий в условиях стерильности сред и всего оборудования обусловлено опасностью инфекции. Наибольший ущерб наносят производству молочнокислые бактерии и бактериофаг, быстро и полностью подавляющие рост ацетоно-бутиловых бактерий. Главная причина попадания бактериофага в производство определяется тем, что он легко задерживается в трещинах сварных швов ферментаторов, трубопроводах и других плохо прогреваемых и порой незаметных участках оборудования. Кроме возможного устранения таких участков наиболее эффективной мерой борьбы с бактериофагом является стерилизация при 120°С не менее 20 мин. В результате внедрения способа непрерывного брожения в ацетоно-бутиловом производстве разработан комплекс мероприятий, позволяющих значительно улучшить условия стерильности и сократить случаи инфицирования в процессе брожения.
.6 Перегонка ацетоно-бутиловой бражки
Ацетоно-бутиловая бражка кроме ацетона, бутилового и этилового спиртов содержит ряд побочных продуктов, для разделения которых применяют довольно сложную перегонку и ректификацию. Изложим только принципиальные особенности этих операций.
На бражной колонне дистиллат всех (трех) растворителей
отделяется от ацетоно-бутиловой барды. Дистиллат укрепляется до концентрации
около 50% и поступает на ацетоновую колонну для отделения ацетона - продукта с
наиболее низкой температурой кипения (56,2°С). Затем на другой колонне отделяют
этанол (температура кипения 78,4°С). Несколько сложнее обстоит дело с
выделением и обезвоживанием бутанола. Смесь бутанола и воды образует два слоя:
верхний - раствор воды в бутаноле (80% бутанола и 20% воды), его называют
"богатой смесью" и нижний - раствор бутанола в воде (8% бутанола и
92% воды), его называют "бедной смесью". Разделение смесей
производится в сосуде - разделителе. Перегонка и обезвоживание бутанола
основаны на его свойстве перегоняться вместе с водой (водяным паром) в виде азеотропной
смеси, кипящей при 93,4°С и содержащей 59% бутанола и 41% воды. Таким образом,
при перегонке "богатой смеси" с верхней части колонны вся вода
удаляется в виде азеотропной смеси, а с нижней части отходит безводный бутанол,
который затем окончательно очищается на бутаноловой колонне (температура
кипения бутанола 117,7°С). При перегонке "бедной смеси" из нижней
части лютерной колонны отходит лютерная вода, а с верхней части - азеотропная
смесь, направляемая потом в соответствующий сосуд - разделитель. Основной отход
ректификации и всего производства - барда, содержит около 3% сухих
веществ, состоящих главным образом их азотистых соединений сырья. Ранее барда
использовалась обычно для откорма скота, но затем на ряде заводов были
построены дрожжевые цехи для выращивания на барде кормовых дрожжей.
4. Основные пути интенсификации процессов биосинтеза в
том числе продуктов ацетоно-бутилового брожения
В результате внедрения способа непрерывного брожения в ацетоно-бутиловом производстве разработан комплекс мероприятий, позволяющих значительно улучшить условия стерильности и сократить случаи инфицирования в процессе брожения.
В результате внедрения способа непрерывного брожения на Нарткалинском ацетоновом заводе при переработке смешанных заторов (с заменой 70% муки) по сравнению с прежней полунепрерывной схемой брожения мучных заторов производительность заметно возрастала.
Непрерывное брожение облегчило замену больших количеств муки (до 70%) более дешевым сырьем: свеклосахарной патокой (мелассой) и гидролизатами отходов растительного сырья.
Наиболее эффективной мерой борьбы с бактериофагом
является стерилизация при 120°С не менее 20 мин. В результате внедрения способа
непрерывного брожения в ацетоно-бутиловом производстве разработан комплекс
мероприятий, позволяющих значительно улучшить условия стерильности и сократить
случаи инфицирования в процессе брожения.
Заключение
Круг вопросов, к решению которых привлекают биотехнологические методы и достижения, достаточно широк. Большинство из них прямо или косвенно связано с глобальными проблемами, стоящими перед современной цивилизацией, такими, как загрязнение окружающей среды, угроза экологического кризиса, истощение запасов полезных ископаемых, опасность мирового энергетического кризиса, нехватка продовольствия, борьба с болезнями. Благодаря достижениям фундаментальных исследований в молекулярной биологии, биохимии, генетической инженерии и новейшим технологиям в биоиндустрии получают новые продукты заданного состава и качества, очищенные от экотоксикантов и обладающие не только питательной ценностью, но и профилактическими свойствами таким путем получена серия продуктов на основе сои, созданы бесхолестериновые и малохолестериновые спрэды ("намазки") типа хальварина и "легкого" сливочного масла, а также безжирового мороженого.
Переработка растительной и микробной биомассы позволяет получать высококачественные белки, масла, пектиновые вещества, пищевые волокна, а также белок, сбалансированный по аминокислотному составу, и компоненты нуклеиновых кислот, необходимые для медицинской, пищевой, косметической и других отраслей промышленности.
Возникла новая научная дисциплина - экологическая биотехнология, осуществляющая новейший подход к охране и сохранению окружающей среды. Разработаны технологии рекультивации почвы, биологической очистки воды и воздуха и биосинтеза препаратов, компенсирующих вредное влияние измененной окружающей среды на людей и животных(Одна из важнейших задач биотехнологии - ограничение масштабов загрязнения нашей планеты промышленными, сельскохозяйственными и бытовыми отходами, токсичными компонентами автомобильных выхлопов. Современные научные исследования нацелены на создание безотходных технологий, на получение легкоразрушаемых полимеров, в том числе биогенного происхождения, а также на поиск новых активных микроорганизмов - разрушителей полимеров (полиэтилена, полипропилена, полихлорвинила). Усилия биотехнологии направлены на борьбу с пестицидными загрязнениями - следствием неумеренного и нерационального применения ядохимикатов. Ведутся разработки технологий по утилизации вредных выбросов (химикалии, нефть), загрязняющих воду почву, и сельскохозяйственных отходов типа молочной сыворотки для получения пищевых и кормовых белковых продуктов, в том числе специальных препаратов, обогащенных, например, селеном дрожжей.
Повышение цен на традиционные источники энергии (природный газ, нефть, уголь) и угроза их исчерпания побудили ученых обратиться к альтернативным путям получения энергии. Роль биотехнологии в создании экономичных возобновляемых энергетических источников (спиртов, биогенных углеводородов, водорода) чрезвычайно велика. Эти экологически чистые виды топлива можно получать путем биоконверсии отходов промышленного и сельскохозяйственного производства. Перспективно продолжение исследований по усовершенствованию и внедрению процессов производства метана, этанола, созданию на основе микроорганизмов (и ферментов) элементов, эффективно производящих электричество, а также по организации искусственного фотосинтеза, в частности биофотолиза воды, при котором можно получать богатые энергией водород и кислород.
Развитие сельскохозяйственной биотехнологии на современном этапе направлено на решение таких глобальных проблем, как повышение плодородия почв, урожайности и качества сельскохозяйственной продукции; рекультивация сельскохозяйственных угодий; улучшение экологической обстановки, способствующей восстановлению биоценоза почв; повышение качества кормов и др. В области медицины весьма перспективной является разработка новых технологий использования молекулярных антител в области диагностики и лечения заболеваний, направленного транспорта лекарственных средств, трансплантологии органов, тканей, клеток, формирования нового класса медицинской техники - индивидуальных биотехнологических систем для контроля состояния организма.
Особый интерес представляют принципиально новые
направления, развитие которых предполагается осуществить в XXI в: электрохемитерапия, молекулярное
моделирование, отдельные области клеточной инженерии (клеточная инкапсуляция,
энергетические межклеточные взаимодействия).
Список литературы
1. Биология культивируемых клеток и биотехнология растений/Под ред. Р. Г. Бутенко. - М., 1991;
. Биотехнология / Под ред. А. А. Баева. - М., 1988;
. Биотехнология растений: культура клеток / Под ред. Р. Г. Бутенко - М., 1989;
. Бейли Дж.Э., ОллисД.Ф, Основы биохимической инженерии. - М 1989.-Ч. II;
. Бутенко Р. Г. и др. Клеточная инженерия. - М., 1987;
. Блинов Н.П. Основы биотехнологии. - СПб., 1995;
. Мишустин Е.Н. Биотехнология. - М., 1989;
. Муромцев Г. С. и др. Основы сельскохозяйственной биотехнологии - М., 1990;
. Промышленная микробиология и успехи генетической инженерии - М., 1984;
. Рыбалъский Н.Г., Скуратовская О. Д. Белковая инженерия. - М., 1990;