Дипломная (вкр): Отъёмно–доливное культивирование микроорганизмов – продуцентов

Первые стадии брожения до образования ацетольдоля протекают подобно маслянокислому брожению. Далее между двумя молекулами ацетальдоля протекает окислительно - восстановительная: оксимасляная кислота и оксибутиловый спирт по следующему уравнению: реакция, в результате которой образуются два соединения: β - оксимасляная кислота и β - оксибутиловый спирт по следующему уравнению:

СН3СНОСН2СНО + Н2О → СН3СНОНСН2СООН + СН3СНОНСН2СН2ОН

β - Оксимасляная кислота далее отщепляет водород и переходит в ацетоуксусную кислоту, которая затем распадается на ацетон и углекислый газ:

СН3СНОНСН2СООН → СН3СОСН2СООН → СН3СОСН3 + СОв -

оксибутиловый спирт подвергается восстановлению до n - бутилового спирта согласно уравнению:

Н3СНОНСН2СН2ОН + Н2 → СН3СН2СН2СН2ОН + Н2О

Часть уксусного альдегида, по-видимому, также вовлекается в окислительно-восстановительную реакцию с образованием уксусной кислоты и этилового спирта:

СН3СНО + СН3СНО + Н2О →СН3СООН + СН3СН2ОН

Бутиловый спирт - продукт брожения некоторых разновидностей маслянокислых бактерий - обнаружен Пастером в 1862 г. Несколько позднее Бейеринк выделил палочковидную бактерию, сбраживающую глицерин с образованием в числе продуктов брожения бутилового спирта. Более подробно вопросом образования при брожении бутанола занимались Фитц и Бухнер, а Шардингер (1905) установил, что некоторые бактерии при росте на средах с углеводами накапливают ацетон. Но все эти исследования сначала представляли чисто теоретический интерес. Положение, однако, изменилось в 1909 г., когда бутиловым спиртом заинтересовались как возможным исходным продуктом для синтеза каучука (через бутадиен). Первый ацетоно-бутиловый завод был построен в Англии в 1914 г. Брожение происходит с одновременным образованием трех продуктов: бутилового спирта, этилового спирта и ацетона.

В период первой мировой войны еще большее значение приобрел второй продукт брожения - ацетон, необходимый для приготовления взрывчатых веществ. Продукты брожения применяются для нужд нитроцеллюлозной и лакокрасочной промышленности, производства фотопленок, ацетилцеллюлозы, органического стекла и других отраслей химической и фармацевтической промышленности.

Несколько позже заводы по производству растворителей были построены в Канаде, США, Индии.

Создание в СССР производства бутилового спирта и ацетона путем брожения явилось результатом работ коллектива ученых, руководимого Шапошниковым. Проведенные ими исследования позволили в 1935 г. осуществить промышленное получение этих продуктов микробиологическим способом на специальном заводе.

1.4 Области применения

Ацетон является популярным растворителем, значительно превосходящим в плане безопасности бензин, скипидар и отчасти керосин. В частности как растворитель используется он: в производстве лаков, в производстве взрывчатых веществ, в производстве лекарственных препаратов

Бутанол используется как растворитель для красок, лаков и олиф, натуральных и синтетических смол, каучуков, растительных масел, красок и алкалоидов. Он играет роль промежуточного звена в производстве фармацевтических препаратов и химикалий, и используется в отраслях промышленности, производящих искусственную кожу, текстиль, небьющееся стекло, резиновый клей, шеллак, плащи, фотографические пленки и духи. Вторичный бутанол также используется как растворитель и химический промежуточный продукт; он входит в состав тормозных жидкостей, промышленных моющих средств, политур, средств для удаления краски, агентов для флотации руды, фруктовых эфирных масел, духов, красителей.

Масляная кислота (бутановая кислота, этилуксусная кислота) - применяют в качестве экстрагента щелочноземельных элементов (кальция, магния, бария), для обеззолевания (удаление солей кальция); в синтезе душистых веществ для парфюмерии пластификаторов, эмульгаторов и др.

2. Методы культивирования продуцентов биологически активных веществ. Указать, какие из существующих методов используются при получении ацетона, бутанола, масляной кислоты

В природе встречается множество микроорганизмов. Но в производстве для микробиологического получения различных веществ используют главным образом чистые культуры, т. е. однородные популяции микроорганизмов одного определенного вида и штамма. Чистую культуру обычно получают из одной изолированной клетки, которую потом постепенно размножают в стерильной среде. Эту работу проводят в стерильном боксе. Чистую культуру удобно изолировать, используя твердые среды Коха - агар, желатин и др. Если на поверхность твердой среды посеять достаточно разведенную суспензию микроорганизмов, то в благоприятных условиях вокруг каждой клетки культуры образуется островок однородных клеток - колония. Клетки из одной колонии при помощи петли или иглы в стерильных условиях переносят в стерильную среду, где они продолжают размножаться.

Для изолирования культур используют также метод Линднера. Согласно этому методу на покровное стекло кончиком пера наносят ряды капель культуры различного разведения и рассматривают в микроскоп каждую каплю. Каплю, где находится только одна клетка, с помощью кусочка стерильной фильтровальной бумаги переносят в стерильную среду. Отдельную клетку из препарата под микроскопом можно изолировать манипулятором.

Получая чистые культуры анаэробных микроорганизмов, работу проводят так, чтобы культура развивалась без доступа воздуха, например используют стеклянные трубочки - капилляры, пастеровские капиллярные пипетки и др. При выращивании микроорганизмов глубинным методом клетки суспендированы в жидкости и находятся во взвешенном состоянии. В небольшую (50 - 250 мл) колбу наливают жидкую питательную среду, в которую засевают чистую культуру либо с поверхности косого агара, либо из ампул. Затем колбу на сутки или более помещают в термостат с определенной температурой, где культура растет и размножается. Чисто аэробные микроорганизмы выращивают в специальных колбах, которые ставят на качалку в термокамере. После этого культуру пересевают в лабораторные ферментаторы со средой такого же или несколько измененного состава. Лабораторные ферментаторы - стеклянные аппараты емкостью 1 -10 л, в которых можно обеспечить продувание среды воздухом, регуляцию температуры, рН и других условий роста. По описанной выше схеме обычно организуют исследование культур микроорганизмов. Кроме того, таким путем готовят и чистую культуру для производственных нужд. Дальнейшее размножение чистой культуры в производственных условиях идет в несколько стадий при использовании металлических инокуляторов объемом от 0,1 до 100 м³ и более. Инокуляторы снабжены мешалками, аэраторами, устройствами для стерилизации и охлаждения, арматурой, измерительными приборами. Для каждой следующей стадии необходимо 3 - 20% посевного материала (по объему).

Последнюю стадию, в которой получают нужный продукт, называют рабочей ферментацией. В культуральнои жидкости, полученной после нее, суспендированы микробная биомасса, остатки питательной среды и экстрацеллюлярные метаболиты. Методами химической технологии из культуральнои жидкости получают биомассу или нужное вещество - спирт, кислоту, аминокислоту, антибиотики и пр.

Аналогично выращиваются и анаэробные микроорганизмы только в этом случае через питательную среду не продувают воздух.

Используя метод поверхностных культур, микроорганизмы выращивают на твердых средах (влажные отруби и др.) или на жидких средах, залитых тонким слоем (2 - 20 см) в специальные кюветы. В этом случае биомасса располагается на поверхности среды. Чаще всего этим методом выращивают грибы, например культуры рода Aspergillus, используемые для получения лимонной кислоты и ферментов. Сначала размножают споры, которыми инфицируют стерильную среду. В камерах с кюветами поддерживают нужную температуру и обеспечивают аэрацию - циркуляцию воздуха между кюветами.

Культивирование микроорганизмов может быть непрерывным и периодическим. При периодическом процессе весь объем питательной среды загружают в аппарат сразу, добавляют посевной материал и при оптимальных условиях продолжают процесс до тех пор, пока не накопится нужное количество биомассы или определенного метаболита. В ходе периодического культивирования изменяется темп роста культуры, ее морфология и физиология. За время культивирования меняется состав среды - уменьшается концентрация питательных веществ, увеличивается содержание метаболитов. С физиологической точки зрения периодическое культивирование невыгодно. В ходе его возникает также ряд технологических трудностей - циклический ход операций, сменные режимы, что затрудняет контроль и регуляцию процесса.

Указанные недостатки устраняются при непрерывном культивировании, методы которого разработали С. В. Лебедев, А. А. Андреев, Н. Д. Иерусалимский и другие ученые. Из непрерывных процессов лучше всего разработан метод глубинной ферментации. В этом случае в ферментатор с культурой продуцента непрерывным потоком подается стерильная среда, а из него непрерывно вытекает готовая культуральная жидкость. Процесс может быть гомо- и гетерогенно непрерывным. При гомогенно непрерывном процессе в аппарате, где идет интенсивное перемешивание, все параметры (концентрация питательных веществ, клеточный титр и др.) постоянны во времени. При гетерогенно непрерывном процессе несколько ферментаторов соединены вместе и образуют каскад.

Питательная среда поступает в первый ферментатор и готовая культуральная жидкость вытекает из последнего ферментатора. Культивирование микроорганизмов в протоке через систему трубок также идет по принципу гетерогенно непрерывного процесса ферментации. В этом случае имеет место непрерывный поток питательной среды, но клетки не обеспечены постоянными условиями роста (сколько аппаратов, столько и условий культивирования).

При непрерывном культивировании микроорганизмов необходимо отрегулировать такую скорость притока питательной среды и вытекания культуральной жидкости, чтобы предотвратить вымывание культуры из системы, т. е. концентрация клеток должна быть постоянной. В стерильных условиях непрерывный, или проточный, метод обеспечивает сохранение культуры в физиологически активном состоянии длительное время.

В промышленности ацетонобутиловое брожение ведут по непрерывному методу или полунепрерывному методу.

3. Технологии получения ацетона и бутанола, включая: характеристику микроорганизмов - продуцентов, источников питания, входящих в состав питательных сред, условия проведения процесса, аппаратурное оформление

.1 Особенности ацетоно-бутилового брожения

Бактерии, образующие в процессе своей жизнедеятельности в значительном количестве ацетон и бутиловый спирт, широко распространены в природе. Они находятся в основном в почве, откуда могут быть довольно легко выделены в виде чистых культур. Относятся к роду Clostridium, который включает большое число видов. Из различных клостридиев, способных к образованию в процессе брожения бутанола и ацетона, наиболее активным их продуцентом признан Clostridium acetobutyllcum, применяемый для производства этих растворителей.

Клетки С. acetobutylicum (рисунок 1) представляют собой палочки (0,6 - 0,9 х 2,4 - 4,7 мкм) с перитрихиальным жгутикованием. Образуют овальные споры, расположенные субтерминально. Споры выдерживают нагревание при 80°С в течение 10 - 30 мин, при 100°С - около 4 мин. Рост культур происходит только в анаэробных условиях на довольно простых средах, содержащих различные углеводы. Кроме углеводов С. acetobutyllcum может сбраживать глицерин, маннит, глюконат, пируват и некоторые другие вещества. Нуждается в таких витаминах, как биотин и парааминобензойная кислота. Бактерия способна к фиксации молекулярного азота. Оптимальная температура для роста 37 - 38°С, оптимальное значение рН среды 5,1 - 6,9.

Благодаря наличию амилолитических ферментов бактерия использует крахмал. Выделяет в среду протеиназы, в результате чего способна разлагать белки. Поэтому С. acetobutyUcutn относят к группе протеолитических клостридиев.

Сбраживание этой бактерией углеводов, как и другими клостридиями, происходит по фруктозобисфосфатному пути, т. е. по пути Эмбдена-Мейергрфа-Парнаса. Продуктами брожения являются уксусная и масляная кислоты, ацетон, бутанол, этанол, а также СО₂ и Н₂. Но состав продуктов и их количества в процессе брожения, а также в зависимости от условий, в которых оно происходит, может меняться.

В результате детального изучения ацетоно-бутилового брожения Шапошников (1939) обнаружил, что оно имеет двухфазный характер.

В течение первой фазы происходит активный рост культур и накопление в среде преимущественно органических кислот. Во вторую фазу рН среды снижается, рост культур замедляется, Преобладает образование нейтральных продуктов, а именно ацетона, бутанола и этанола. В то же время количество органических кислот в среде может даже уменьшаться (рисунок 2).

Рисунок 2 - Динамика ацетоно-бутилового брожения (по Шапошникову, 1948) 1 - общее количество нейтральных продуктов, 2 - ацетон, 3 - кислотность, 4 - газовыделение

Аналогичная двухфазность, как было установлено в дальнейшем, характерна для большинства процессов брожений, а также некоторых других микробиологических процессов, что важно знать для их практического применения.

Для ацетоно-бутилового брожения четко показано, что его двухфазность связана с рН среды. Если значение рН среды в результате накопления органических кислот падает до 4,5 и ниже, начинается интенсивное образование нейтральных продуктов. В результате этого предупреждается дальнейшее подкисление среды, неблагоприятное для бактерий. Если значение рН среды путем добавления в нее мела или другими способами поддерживать на уровне 5,0 и выше, то образования в большом количестве ацетона, бутанола и этанола не происходит.

Установлено, что при низких значениях рН у С. acetobutyliсит увеличивается активность ферментов, катализирующих превращение ацетоацетил-КоА в ацетон (рисунок 2) и больше НАДН используется на/восстановление бутирил-КоА до бутанола. Кроме того, бутанол может частично синтезироваться из ранее образованной масляной кислоты, вновь поступающей в клетки из среды и превращающейся в бутирил-КоА. Поэтому для получения в большом количестве нейтральных продуктов важно соблюдать определенные условия процесса брожения.

.2 Производственные среды

Ацетоно-бутиловое брожение в производственных условиях может вестись на разных углеводсодержащих средах. Вначале обычно использовали среды, содержащие кукурузную, пшеничную или ржаную муку. В настоящее время в качестве основного сбраживаемого субстрата нередко применяют мелассу и некоторые другие дешевые вещества. Сбраживаемые углеводы не подвергают предварительному осахариванию. Поэтому содержащие их среды именуются заторами (в отличие от сусла - осахаренной среды спиртового брожения).

Обычно используют заторы, содержащие около 6 % углеводов. Использовать среды с большем количеством сбраживаемых субстратов нецелесообразно, так как образуемый при брожении бутанол уже в концентрации 1,5 % подавляет жизнедеятельность бактерий и брожение прекращается. Поэтому часть углеводов, если их много, остается неиспользованной.

В случае, когда в качестве субстрата для брожения применяют муку, ее предварительно взвешивают на автоматических весах, а затем через дозатор направляют на смешение с водой при 50 - 60°С. Замес проходит ловушки для улавливания комков, а также случайных примесей и поступает на разваривание в варочно-стерилизационные колонки, где нагревается паром до 145 - 160°С и выдерживается при Такой же температуре в трубчатых вертикальных сосудах от 20 до 40 мин, постепенно продвигаясь по ним. Проходя через сепаратор пара, затор подается центробежным насосом в холодильник типа "труба в трубе", охлаждается до температуры брожения (35 - 36°С) и поступает в бродильное отделение.