-при анализе воды на индикаторные микроорганизмы – не менее
500 см3;
-при анализе воды на индикаторные и патогенные микроорганизмы (сальмонеллы, шигеллы) – 300 см3.
Отобранную пробу маркируют, прикрепляют этикетки к емкости,
составляется акт об отборе проб воды с указанием расположением и наименованием места отбора проб, даты отбора, метода отбора, времени отбора, климатических условий окружающей среды при отборе проб, температуре воды, должности и фамилии исполнителя.
В лабораторию пробы питьевой воды доставляют в контейнераххолодильниках при температуре 4-100С. Время начала исследований от момента отбора проб не должно превышать 6 часов, если пробы нельзя охладить, то их анализ проводят в течение 2 часов после забора пробы.
Определение общего числа микроорганизмов, образующих колонии на питательном агаре. Из каждой пробы производят посев не менее двух объемов по 1 мл, далее вносят по 1мл воды в стерильные чашки Петри и прибавляют в каждую чашку по 8-12 мл расплавленного и остуженного до 450С питательного агара. Содержимое чашек быстро и равномерно смешивают, избегая образования пузырьков воздуха и попадания агара на края и крышку чашки. Чашки с застывшим агаром инкубируют; учитывают только те из них, на которых выросли не более 300 изолированных колоний. Результат выражают числом KOЕ в 1 мл исследуемой пробы воды.
Термотолерантные и общие колиформные бактерии оценивают методом мембранной фильтрации или титрационным методом.
Метод мембранной фильтрации. Берут объем воды равный 300
мл и фильтруют по 100 мл через разные стерильные нитроцеллюлозные фильтры фильтры (используются микрофильтрационные установки с диаметром фильтрующей поверхности 35 или 47 мм и вакуумным насосом для создания разрежения 0,5-1 атм), которые затем накладывают на поверхность дифференциальной диагностической среды Эндо. Подсчитывают количество красных лактозоположительных колоний на среде Эндо, готовят из колоний мазки, окрашивают по Граму в поисках грамотрицательных палочек, определяют оксидазный тест, который должен быть у энтеробактерий отрицательным.
Затем пересевают колонии с грамотрицательными палочками и отрицательным оксидазным тестом на полужидкую среду с лактозой (маннитом, глюкозой) и инкубируют в термостате при 37 С в течение 24 часов для определения количества общих колиформных бактерий. Для определения термотолерантных колиформных бактерий посев производят в среду, подогретую до 44оС, и инкубируют в термостате при 44оС в течение 24 часов.
110
Колонии учитывают как общие колиформные бактерии при отрицательном оксидазном тесте, ферментации лактозы или маннита (глюкозы) при 37оС с образованием кислоты и газа.
Колонии учитывают как термотолерантные колиформные бактерии при отрицательном оксидазном тесте и ферментации лактозы или маннита (глюкозы) при 44оС с образованием кислоты и газа.
Титрационный метод. Его обычно используют для качественной оценки питьевой воды при невозможности применения метода мембранной фильтрации или при наличии в воде большого количества взвешенных веществ. Объем воды 300 мл разделяют на 3 объема по 100 мл, засевают эти пробы на лактозопептонную среду и инкубируют при 37оС в течение 24-48 часов. При наличии роста делают пересев из этих объемов на среду Эндо, далее лактозоположительные колонии идентифицируют как в предыдущем методе. Количество колиформных бактерий в этом методе определяют по специальным таблицам.
Определение спор сульфитредуцирующих клостридий мето-
дом мембранной фильтрации. Сульфитредуцирующие клостридии (в основном это Clostridium perfringens) – палочки, грамположительные, строгие анаэробы, имеющие спору и редуцирующие сульфит натрия при температуре 440С в течение 24 часов на железо-сульфитном агаре.
Метод основан на фильтровании 20 мл воды через мембранные фильтры, помещении их в горячий железо-сульфитный агар, сразу же после посева пробирку с агаром и фильтром для создания анаэробных условий быстро охлаждают, культивируют посевы при температуре 440С в течение 24 часов. При учете результатов подсчитывают черные изолированные колонии, выросшие как на фильтрах, так и в толще питательной среды. Результат анализа выражают числом колонийобразующих единиц (КОЭ) спор сульфитредуциирующих клостридий в 20 мл воды.
Определение колифагов производят титрационным и прямым методами. Колифаги способны лизировать E. coli (используется эталонная тест-культура E. coli К12 StrR) при температуре 370С и образовывать через 18-20 часов на питательном агаре зоны лизиса.
Принцип метода основан на предварительном подращивании колифагов в среде обогащения в присутствии E. coli и образовании бляшек колифага на газоне E. coli на питательном агаре. Определение наиболее вероятного числа колифагов производят по специальной таблице.
Санитарно–бактериологическое исследование воздуха и без-
опастность воздуха в эпидемиологическом отношении определяется соответствием его нормативам (Сан Пин 2.1.6. 9-18-2002 «Гигиенические требования к охране атмосферного воздуха населенных пунк-
111
тов»). Методы микробиологического исследования воздуха подразде-
ляют на седиментационные и аспирационные. Наиболее простым яв-
ляется седиментационный метод Коха: стерильные чашки Петри с плотной питательной средой открывают в местах отбора проб воздуха и выдерживают в течение определенного времени (5-30 мин), после чего закрывают и термостатируют. По количеству выросших колоний подсчитывают микробное число воздуха. Для определения патогенных стафилококков берут чашки с желточно-солевым агаром и выдерживают 15 минут, для определения стрептококков используют чашки с кровяным агаром, для определения плесневых и дрожжевых грибов – среду Сабуро, для определения грамотрицательных неферментирующих бактерий – чашки с МПА или ЦПХ-агаром, выдерживают открытыми 2 часа. После экспозиции чашки закрывают, переворачивают, помещают в термостат и инкубируют при температуре 370С в течение 24 часов. После инкубации проводят учет количества выросших колоний микроорганизмов и при необходимости проводят идентификацию до рода и вида. Наиболее точными являются аспирационные методы исследования воздуха, основанные на фильтрации или аспирации (просасывании) воздуха через специальные фильтры, жидкости, порошки, адсорбирующие микрофлору.
Отбор проб воздуха в помещениях стационара производят на уровне дыхания лежащего больного или на высоте рабочего стола.
Количество микробов в воздухе варьирует в широких диапазонах
– от нескольких бактерий до десятков тысяч в 1 м3. В 1 г пыли может содержаться до 1млн бактерий. Большое значение имеет чистота воздуха в операционных, реанимационных и перевязочных отделениях хирургического стационара. Общее количество микробов в операци-
онных до операции не должно превышать 500 в 1 м3, а после операции – 100 в 1 м3.
Санитарно–бактериологическое исследование почвы включа-
ет определение микробного числа и содержания санитарнопоказательных микроорганизмов почвы.
Гигиеническая оценка почвы населенных мест проводится согласно инструкции 2.1.7. 11-12-5-2004.
Оценка санитарного состояния почвы проводится по результатам анализов почв на объектах повышенного риска (детские сады, игровые площадки, зоны санитарной охраны) и в санитарно-защитных зонах по следующим показателям – санитарно-показательные микроорганизмы бактерий группы кишечной палочки (БГКП) – общие колиформные бактерии, фекальные энтерококки. На свежее фекальное загрязнение почвы указывает наличие высокого индекса БГКП при низких титрах нитрофикаторов, термофилов и высоком содержании веге-
112
тативных форм Clostridium perfringens. Обнаружение энтерококков свидетельствует о свежем фекальном загрязнении.
Обнаружение возбудителей кишечных инфекций, патогенных энтеробактерий и энтеровирусов свидетельствует об эпидемической опасности почвы.
Почву оценивают как чистую при отсутствии патогенных бактерий и индексе санитпрно-показательных микроорганизмов до 10 клеток на 1 г почвы.
При загрязнении почвы сальмонеллами индекс санитарнопоказательных микроорганизмов БГКП и энтерококков достигает 10 клеток на 1 г почвы и более.
Концентрация колифага в почве на уровне 10 БОЕ/г свидетельствует о загрязнении почвы.
Отбор проб для бактериологического анализа проводится не реже 1 раза в год в местах возможного нахождения людей, животных, в местах загрязения органическими отходами.
Образец почвы тщательно перемешивают, из него отбирают навески, величины которых вибирают исходя из предполагаемой степени загрязнения почвы и планируемых определений. Для учета почвенных микроорганизмов достаточно навески от 1 до 10 г. Первое разведение навески почвы (1:10) делают в стерильной посуде на стерильной водопроводной воде. После приготовления разведений применяют соответствующую обработку почвы с целью извлечения клеток микроорганизмов из почвенных агрегатов при помощи 10минутного вериткального встряхивания почвенной суспензии первого разведения в пробирках с резиновыми пробками. Почву разводят до 0,0001-0,00001 г/мл. приготовленные разведения используют для посева на различные питательные среды.
Микробное число почвы – это общее количество микроорганизмов, содержащихся в 1 г почвы.
По микробному числу почвы судят об общей численности в основном сапрофитных микроорганизмов, вырастающих на МПА и сус- ло-агаре; если же необходимо выделить определенные группы микроорганизмов (например, азотфиксирующие, разлагающие клетчатку, продуцирующие антибиотики, нитрифицирующие, некоторые патогенные и т.д.), используют специальные среды и методы посева.
Для определения коли-титра почвы используют элективные питательные среды, содержащие желчь и генциановый фиолетовый, подавляющие рост многочисленных микроорганизмов, населяющих почву, но не препятствующие росту кишечной палочки. Наиболее употребительной является жидкая среда Кесслера, которая, кроме вышеназванных компонентов, содержит пептон и лактозу, сбраживаемую E.сoli, для улавливания образовавшегося газа служат поплавок.
113
После суточной инкубации посевов разведений почвы на среде Кесслера отбирают положительные пробы, в которых наблюдается обильное газообразование и диффузный рост, эти признаки характерны для развития E. coli, ферментирующей лактозу с образованием газа, скапливающегося в поплавке. Из отобранных посевов делают высевы на среду Эндо, инкубируют при 37 С 24 ч, отмечают характерные для E. coli темно-красные колонии с металлическим блеском, производят микроскопию и при наличии в мазках мелких грамотрицательных палочек делают вывод о присутствии E. coli.
Перфрингенс-титр почвы – наименьшее ее количество, выраженное в граммах, в котором содержится одна жизнеспособная клетка C. perfringens. Для определения C. perfringens в почве используют желе- зо-сульфитный агар (среду Вильсона-Блера).
Перфрингенс-титр определяется максимальным разведением почвенной суспензии, при посеве которого развиваются характерные черные колонии. В некоторых случаях, кроме среды Вильсона-Блера, используют молочные среды (среду Тукаева). На этой среде C. perfringens энергично сбраживает лактозу, молоко быстро (в течение 3-4 ч) створаживается, образующийся газ разрывает сгустки казеина и вытесняет их в верхнюю часть пробирки. Наличие C. perfringens на средах Вильсона-Блера и Тукаева подтверждается микроскопически. В мазках, окрашенных по Граму, бациллы имеют вид крупных грамположительных палочек с прямыми концами, которые могут располагаться цепочками.
Присутствие в почве E. coli и Enterococcus faecalis указывает на свежее фекальное загрязнение; бактерии родов Citrobacter, Enterobacter и Clostridium perfringens – на давнее фекальное загрязне-
ние. Высокая численность сапрофитной микрофлоры свидетельствует об органическом загрязнении.
Определение общих колиформных бактерий (ОКБ). При ана-
лизе почв, для которых предполагается невысокая степень фекального загрязнения, рекомендуется использовать титрационный метод. В качестве ускоренного метода для анализа слабозагрязненных почв можно использовать метод мембранной фильтрации. При анализах проб с предполагаемой высокой степенью фекального загрязнения целесообразно проводить прямой посев разведении суспензии на поверхность среды Эндо.
Титрационный метод. Из первого разведения почвенной суспензии (1:10), прошедшей предварительную обработку, стерильной пипеткой берут 10 мл, что соответствует 1 г почвы, и засевают во флаконы с 50 мл жидкой лактозо-пептонной среды или среды Кесслера. Посев меньших количеств (0,01 г; 0,001 г и т.д.) делают по 1 мл из соответствующих разведении почвенной суспензии в пробирки с 9 мл
114