1)СТРОЕНИЕ БАКТЕРИАЛЬНОЙ КЛЕТКИ:
Клетка прокариотических организмов имеет сложное строго упорядоченное строение и обладает принципиальными особенностями ультраструктурной организации и химического состава.
Бактериальная клетка состоит из клеточной стенки, цитоплазматической мембраны, цитоплазмы с включениями и яд¬ра, называемого нуклеоидом. Имеются дополни¬тельные структуры: капсула, микрокапсула, слизь, жгутики, пили. Некоторые бактерии в неблагоприятных условиях спо¬собны образовывать споры.
Функции клеточной стенки:
1. Определяет и сохраняет постоянную форму клетки.
2. Защищает клетку от механических и осмотичес¬ких сил внешней среды.
3. Участвует в регуляции роста и деления клеток.
4. Обеспечивает коммуникацию с внешней средой через каналы и поры.
5. Несет на себе специфические рецепторы для бактериофагов.
6. Определяет во многом антигенную характеристику бактерий (природу и спе¬цифичность О- и К-антигенов).
7. Содержащийся в ее составе пептидогликан наделяет клетку важными иммуно¬биологическими свойствами.
8. Нарушение синтеза клеточной стенки бактерий является главной причиной их L-трансформации.
Метод выявления клеточной стенки - электронная микроскопия, плазмолиз.Термин «оболочка» в настоящее время используется для обозначения клеточной стенки и капсулы бактерий или только клеточной стенки, цитоплазматическая мембрана не входит в состав оболочки и относится к протопласту.
Основным компонентом клеточной стенки бактерий является пептидогликан, или муреин (лат. murus — стенка), — опорный полимер, имеющий сетчатую структуру и образующий ригидный (жесткий) наружный каркас бактериальной клетки.
2)СПОРА БАКТЕРИЙ, СТРОЕНИЕ, НАЗНАЧЕНИЕ, ОТЛИЧИЕ ОТ СПОР ГРИБОВ.
Споры бактерий — тельца круглой или овальной формы, которые образуются внутри некоторых бактерий в определенные стадии их существования или при ухудшении условий окружающей среды. Размер, форма и расположение спор в клетке — признак относительно постоянный, характерный для некоторых видов бактерий. Споры бактерий устойчивы к различным физическим и химическим воздействиям, не окрашиваются обычными анилиновыми красителями и сохраняются в течение нескольких лет, не утрачивая свойства прорастать в вегетативную форму, что имеет значение в эпидемиологии ряда заболеваний. Споры бактерий погибают после прогревания в автоклаве при t° 120° в течение 30 минут или при обработке сухим жаром при t° 160— 180° в течение часа.
В зрелой споре различимы: центральный, плохо окрашиваемый участок (спороплазма), двухслойная ЦПМ и оболочка споры.
Спороплазма (протопласт споры) включает цитоплазму, бактериальную хромосому, системы белкового синтеза и некоторые другие (например, анаэробного энергообразования).
Оболочка споры двухслойная: пространство между слоями заполняют гликопептидные полимеры, сходные с пептидогликанами, образующие сетчатую структуру (кортекс), проявляющую высокую чувствительность к лизоциму.
Внутренний слой (стенка споры) образован пептидогликанами, аналогичными таковым \ вегетирующей клетки.
Внешний слой (собственно оболочка) образуют кератиноподобные белковые структуры с низкой проницаемостью.
Экзоспориум. У некоторых бактерий материнская клетка образует экзоспориум — двух-трёхслойное желатинообразное покрытие образованное липопротеинами и углеводами и во многом аналогичное капсуле бактерий. При созревании споры экзоспориум может сохраняться в виде пустого и отстающего от споры «мешка»
Споры представляют собой своеобразные покоящиеся клетки; у них чрезвычайно низкая метаболическая активность, но они обладают высокой устойчивостью к высушиванию, действию повышенной температуры и различных химических веществ. Высокую резистентность спор к действию указанных факторов связывают с присутствием в оболочке большого количества кальциевой соли дипиколиновой кислоты. Споры сильно преломляют свет, поэтому они хорошо заметны в неокрашенных препаратах.
Споры грибов ,в отличие от бактерий ,служат для размножения. У грибов споры могут развиваться внутри специальных споровместилищ (эндогенно) или на конце особых выростов мицелия — конидиеносцах (экзогенно).
3)ОСНОВНЫЕ ЭЛЕМЕНТЫ БЕЛОКСИНТЕЗИРУЮЩЕЙ СИСТЕМЫ БАКТЕРИЙ.
Синтез белка осуществляется с помощью сложной белоксинтезирующей системы. В ее состав входят следующие компоненты:
1. Рибосомные субъединицы 30S и 50S, которые у прокариот и в митохондриях и хлоропластах эукариот образуют рибосому 70S; или субъединицы 40S и 60S, образующие у эукариот рибосому 80S.
2. Матричная РНК (мРНК).
3. Полный комплект двадцати аминоацил-тРНК, для образования которых необходимы соответствующие аминокислоты, аминоацил-тРНК-синтетазы, тРНК и АТФ. Аминоацил-тРНК (аа тРНК) - это заряженная энергией и связанная с тРНК аминокислота, готовая для подвоза к рибосоме и включения в синтезирующийся на ней полипептид.
4. Белковые факторы инициации (у прокариот - IF-1, IF-2, IF-3).
5. Белковые факторы элонгации (у прокариот - EF-Tu, EF-Ts, EF-G).
6. Белковые факторы терминации (у прокариот - RF-1, RF-2, RF-3).
7. Некоторые другие белковые факторы (ассоциации, диссоциации субъединиц, высвобождения и пр.).
8. Гуанозинтрифосфат (ГТФ).
9. Неорганические катионы в определенной концентрации.
4)ПРИНЦИП ФАЗОВО-КОНТРАСТНОЙ МИКРОСКОПИИ
При микроскопии неокрашенных микроорганизмов, отличающихся от окружающей среды только по показателю преломления, изменения интенсивности света (амплитуды) не происходит, а изменяется только фаза прошедших световых волн. Поэтому глаз этих изменений заметить не может и наблюдаемые объекты выглядят малоконтрастными, прозрачными. Для наблюдения таких объектов используют фазово-контрастную микроскопию, основанную на превращении невидимых фазовых изменений, вносимых объектом, в амплитудные, различимые глазом.
Фазово-контрастное устройство может быть установлено на любом световом микроскопе и состоит из:
1) набора объективов со специальными фазовым пластинками;
2) конденсора с поворачивающимся диском. В нем установлены кольцевые диафрагмы, соответствующие фазовым пластинкам в каждом из объективов;
3) вспомогательного микроскопа.
Благодаря применению этого способа микроскопии контраст живых неокрашенных микроорганизмов резко увеличивается и они выглядят темными на светлом фоне (позитивный фазовый контраст) или светлыми на темном фоне (негативный фазовый контраст).
5)ПРИНЦИП ТЕМНОПОЛЬНОЙ МИКРОСКОПИИ
Темнопольная микроскопия позволяет наблюдать живые бактерии. Для темнопольной микроскопии используют темнопольный конденсор, выделяющий контрастирующие структуры неокрашенного материала
Темнопольная микроскопия. Микроскопия в темном поле зрения основана на явлении дифракции света при сильном боковом освещении взвешенных в жидкости мельчайших частиц (эффект Тиндаля). Эффект достигается с помощью параболоид-или кардиоидконденсора, которые заменяют обычный конденсор в биологическом микроскопе .(препарат освещается сбоку косыми пучками лучей .не попадающими в объектив.)
6)ОСНОВНЫЕ ОТЛИЧИЯ МОЖДУ ПРОКАРИОТАМИ И ЭУКАРИАОТАМИ.
У прокариот нет ядра, кольцевая ДНК (кольцевая хромосома) расположена прямо в цитоплазме (этот участок цитоплазмы называется нуклеоид).
У эукариот есть оформленное ядро (наследственная информация [ДНК] отделена от цитоплазмы ядерной оболочкой).
1) Раз у прокариот нет ядра, то нет и митоза/мейоза. Бактерии размножаются делением надвое.
2) У прокариот из органоидов имеются только рибосомы (мелкие, 70S), а у эукариот кроме рибосом (крупных, 80S) имеется множество других органоидов: митохондрии, эндоплазматическая сеть, клеточный центр, и т.д.
3) Клетка прокариот гораздо меньше клетки эукариот: по диаметру в 10 раз, по объему – в 1000 раз.
Прокариоты отличаются от эукариот по ряду основных признаков.
1.Отсутствие истинного дифференцированного ядра (ядерной мембраны).
2.Отсутствие развитой эндоплазматической сети, аппарата Гольджи.
3.Отсутствие митохондрий, хлоропластов, лизосом.
4.Неспособность к эндоцитозу (захвату частиц пищи).
5.Клеточное деление не связано с циклическими изменениями строения клетки.
6. Значительно меньшие размеры (как правило). Большая часть бактерий имеет размеры 0,5- 0,8 микрометров (мкм) х 2- 3 мкм.
7)ПРИЗНАКИ ПРИМЕНЯЕМЫЕ ДЛЯ ИДЕНТИФИКАЦИИ МИКРООРГАНИЗМОВ.
Морфологические-форма,величина,характер расположения микробов друг к другу.
Тинкториальные –способность микробов окрашиваться различными красителями.
Культуральные-особенности роста микробов на жидких и плотных питательных средах.
Биохимические-способность организмов потреблять различные вещества (углеводы,белки и др)с образованием конечных продуктов или наличие у микроорганизмов различных ферментов(уретаза,цистиназа и др)
Антигенные-особенности хим.состава микробных клеток (антигенной структуры) выявляемые с помощью спец диагностич.сывороток чувствительность к спец. фагам.
8)ОПРЕДЕЛЕНИЯ ВСЕХ МЕТОДОВ МИКРОБИОЛОГИЧЕСКОЙ ДИАГНОСТИКИ
Микроскопический. С помощью микроскопии нативного патологического материала определяют вид возбудителя заболевания по форме, взаиморасположению и способности окрашиваться определенными кра¬сителями.
Бактериологический. Этот метод основан на выделении чистой культуры возбудителя заболевания и его идентификации (определение вида микроба).
Серологический. Метод основан на определении специфических антител в крови больных или переболевших инфекционными заболева¬ниями к соответствующим возбудителям с помощью различных реакций (агглютинации, пассивной гемагглютинации, связывания комплемента, преципитации и других).
Биологический. В основе этого метода лежит заражение лабораторных животных исследуемым материалом от больного с целью воспроизведения у них инфекционного заболевания или последующего выделения возбудителя.
Аллергический. С помощью этого метода обнаруживают повышен¬ную чувствительность макроорганизма к определенным возбудителям инфекционных заболеваний или продуктам их жизнедеятельности. Для аллергических проб используют препараты, которые называются аллергенами.
Жгутик — спирально изогнутая полая нить, образованная субъединицами флагеллина. У разных бактерий толщина жгутиков варьирует от 12 до 18 нм, что составляет не более 1/10 диаметра жгутиков водорослей и простейших. Жгутики также различают по длине и диаметру витка. Место прикрепления жгутика к бактериальной клетке имеет сложное строение и состоит из базальной структуры и так называемого «крюка» (рис. 4-2). У грамположительных бактерий в состав базальной структуры входит одна пара, а у грамотрицательных бактерий — две пары колец. Кольца играют роль «приводного диска» и «подшипника». Вся конструкция выполняет функцию хемомеханического преобразователя (флагеллиновый мотор). У спирохет за движение ответственна особая органел-ла — осевая нить, состоящая из двух рядов бактериальных жгутиков, расположенных продольно внутри клетки.
Жгутики бактерий состоят из трёх субструктур:
Филамент (фибрилла, пропеллер) — полая белковая нить толщиной 10—20 нм и длиной 3—15 мкм, состоящая из флагеллина, субъединицы которого уложены по спирали. Полость внутри используется при синтезе жгутика — он происходит в направлении от плазматической мембраны. По полости к собираемому в настоящий момент участку переносятся субъединицы флагеллина.
Крюк — более толстое, чем филамент (20—45 нм), белковое (не флагеллиновое) образование.
Базальное тело (трансмембранный мотор)
Расположение жгутиков — характерный признак, имеющий таксономическое значение. У некоторых бактерий жгутики расположены по всей поверхности клеточной стенки (например, у бактерий рода Proteus), такие бактерии известны как перитрихи [от греч. peri-, вокруг, + trichos, волос].
Некоторые бактерии снабжены только одним толстым жгутиком (например, представители рода Vibrio), они известны как монотрихи.
Политрихи — бактерии, имеющие одиночный по виду жгутик, образованный пучком из 2-50 жгутиков. Полярные жгутики прикреплены к одному или обоим концам бактерии.
Монополярно-политрихиальное расположение жгутиков имеют лофотрихи [от греч. lophos, пучок, + trichos, волос], к ним, например, относят представителей рода Pseudomonas.
Биполярно-политрихиальное жгутикование имеют амфитрихи [от греч. amphi-, двусторонний, + trichos, волос] (например, бактерии рода Spirillum).
11)МЕТОДЫ ОПРЕДЕЛЕНИЯ ПОДВИЖНОСТИ БАКТЕРИЙ
Подвижность бактерий определяют микроскопией препаратов в «раздавленной» или «висячей» капле. Способность к движению можно определять также после внесения культуры бактерий уколом в столбик полужидкого агара (подвижные виды растут по всей толще среды, неподвижные — по уколу) или посевом бактерий в водный конденсат скошенного столбика агара (подвижные виды переплывают из конденсата на поверхность среды и колонизируют её), либо определяют способность бактерий давать «феномен роения».
12)СТРУКТУРА ПЕПТИДОГЛИКАНА
(Муреин) Пептидогликан образует упорядоченную структуру ячеистого строения, построенную из N-ацетилглюкозамина и N-ацетилмурамовой кислоты, соединенных β-1,4-гликозидными связями. Остатки N-ацетилмурамовой кислоты сшиты между собой при помощи коротких пептидов (сшивка производится ферментом транспептидазой). Типично пептидная цепочка содержит L-аланин, D-глутаминовую кислоту, мезо-диаминопимелиновую кислоту, L-лизин, D-аланин (следует отметить, что мезо-диаминопимелиновая кислота и D-аминокислоты в составе клеточных структур встречаются только в прокариотических клетках). Такая трёхмерная структура сообщает клеточной стенке бактерий прочность и защиту от осмотического лизиса.
Принцип окраски по Граму основан на том, что положительно красящиеся по Граму микробы имеют в своем поверхностном слое вещества (рибонуклеат магния с белками), которые при окрашивании парарозанилиновыми красками (генцианвиолет, кристаллвиолет, метилвиолет, викторияблау) в присутствии иода дают прочные соединения, не разрушающиеся спиртом. Микробы, отрицательно красящиеся по Граму, в своем составе не имеют таких веществ и потому при окрашивании этими красками в присутствии иода не дают прочных соединений, и при действии спирта обесцвечиваются. Выяснено, что окрашенный комплекс образуется на протопласте , но его удерживание клеткой или вымывание из нее при последующей обработке спиртом определяются особенностями строения клеточной стенки.
14)В КАКИХ СЛУЧАЯХ ИМСПОЛЬЗУЮТСЯ ТЕМИНЫ : «БАКТЕРИИ», «БАЦИЛЛЫ», «КЛОСТРИДИИ»
Термин «Бактерии» используется для прокариотических микрооганизмов, чаще всего одноклеточных.
Термин «Бациллы» используется для грамположительных палочковидных бактерий,образующих внутриклеточные споры.
Темин «клостридии» используется для обозначения рода грамположительных облигатно-анаэробных бактерий способных продуцировать эндоспоры.
15)ЧТО ТАКОЕ L ФОРМЫ БАКТЕРИЙ ,В КАКИХ СЛУЧАЯХ ОНИ ВОЗНИКАЮТ
L-формы — бактерии, частично или полностью лишённые клеточной стенки, но сохранившие способность к развитию. Было показано, что L-формы возникают спонтанно или индуцировано - под воздействием агентов, блокирующих синтез клеточной стенки: антибиотиков (пенициллины циклосерин, цефалоспорины, ванкомицин), ферментов (лизоцим, амидаза, эндопептидаза) ультрафиолетовых и рентгеновских лучей, аминокислоты глицина.
L-формы образуются в результате несбалансированного роста нормальных бактериальных клеток в длину и в толщину и поэтому полиморфны. В культурах L-форм обнаруживаются шаровидные, нитевидные или вовсе бесструктурные клетки размером от 0,2 до 50 мкм. Они спокойно проходят через бактериальные фильтры и легко разрушаются при механических воздействиях. В отличие от нормальных клеток L-формы часто содержат крупные вакуоли. Их метаболическая активность очень низкая. Клеточное деление происходит нестандартно, за счёт образования элементарных тел путём отпочкования от поверхности клетки или от мембраны вакуоли.
16)МЕТОДЫ ВЫЯВЛЕНИЯ СПОР У БАКТЕРИЙ
Обнаружение спор.
Благодаря толщине свое оболочки и плотности содержимого, споры остаются неокрашенными при обработке препарата анилиновыми красителями простым методом или сложным по Граму.
При окраске по Граму или по Леффлеру спора внутри окрашенной цитоплазмы микробной клетки выглядит как зернышко круглой или овальной формы, сильно преломляющее свет.
Существует несколько методов окраски спор (по Циль – Нильсену, по Ганзену, по Ожешко и др.) позволяющих достигнуть контрастной окраски спор в цитоплазме.
Методика окраски микропрепарата:
1) На фиксированный препарат накладывается полоска фильтровальной бумаги (для защиты препарата от оседающих кристаллов красителя) и на нее наливается карболовый фуксин Циля. Препарат осторожно прогревается в течение 3 – 4 минут над пламенем горелки. По мере испарения жидкости краситель добавляется.
2) Фильтровальная бумага снимается и на мазок наносится 2 – 3 капли 5% раствора кислоты (серной, соляной, азотной или уксусной) на 30 секунд.
3) Препарат тщательно промывается струей холодной воды и высушивается.
4) Докрашивается раствором метиленовой сини Леффлера в течение 1 – 2 минут.
5) Препарат промывается струей воды, высушивается и микроскопируется. На голубом фоне цитоплазмы видны сиренево – красные споры.
Этот метод позволяет обнаружить споры не только в процессе их формирования внутри клетки, но и после того как сформированная спора высыпалась из разрушившейся микробной клетки.
Приготовление карболового фуксина Циля:10 мл. насыщенного спиртового раствора фуксина растворяют в 100 мл 5% раствора карболовой кислоты.
17)ЧТО ТАКОЕ НУМЕРИЧЕСКАЯ ТАКСОНОМИЯ
Таксономия нумерическая
метод феносистематики, состоящий в получении максимальной информации об иссл. микробе. Проводится в несколько этапов: 1) отбор иссл. к-р и типовых штаммов; 2) выбор признаков и их кодирование; 3) определение признаков; 4) компьютерный анализ результатов; 5) интерпретация результатов на основе степени сходства и различий. При кодировании все признаки уравниваются или располагаются иерархически.
Нумерическая (численная) таксономия основывается на использовании максимального количества сопоставляемых признаков и математическом учете степени соответствия. Больщое число сравниваемых фенотипических признаков и принцип их равной значимости затрудняло классификацию.
18)ЧТО ТАКОЕ КОНСТИТУТИВНЫЕ,ИНДУЦИБЕЛЬНЫЕ, РЕПРЕСИБЕЛЬНЫЕ ФЕРМЕНТЫ
1. конститутивные - синтез которых происходит с определенным постоянством и не зависит от субстрата и конечного продукта
2. индуцибельные- синтез которых усиливается при наличии в окружающей среде субстрата для этих ферментов
3.репресибельные- синтез которых подавляется при наличии конечного продукта реакции в окружающей среде
19)ОТЛИЧАЕ МЕЖДУ ЯДЕРНЫМ АППАРАТОМ ПРОКАРИОТ И ЭУКАРИОТ
Принципиальное и наиболее заметное различие между этими двумя группами организмов заключается в том, что эукариоты имеют особый органоид – ядро, т. е. генетический материал обособлен и отделен от цитоплазмы ядерной оболочкой. Наследственная информация заключена в хромосомах, содержащих ДНК и особые белки. Деление происходит в результате сложного процесса, называемого митозом. Однако неправильно будет сказать, что прокариоты не имеют ядра, так как у них есть ядроподобные структуры – нуклеоиды. Более корректное выражение: прокариоты не имеют оформленного ядра, так как нукле-оиды имеют более простое строение и не отделены от цитоплазмы мембраной. Наследственную информацию несет одна хромосома, представляющая собой длинную молекулу ДНК.