Статья: Моделирование острого пиелонефрита у животных различного вида

Экспериментальные и клинические исследования

Бюллетень сибирской медицины, № 4, 2006 47

Омская государственная медицинская академия

Моделирование острого пиелонефрита у животных различного вида

Лукьянов А.В.

Долгих В.Т.

Выполнение экспериментального исследования с позиций биомедицинской этики было обосновано следующими причинами: многие аспекты патогенеза инфекций мочевой системы (ИМС), в том числе острого пиелонефрита, недостаточно изучены и не могут исследоваться в клинике. Неоперационная биопсия органов мочевой системы у больных с острыми инфекционно-воспалительными поражениями в клинической практике не проводится. У больного человека, как правило, не представляется возможным наблюдать развитие инфекционного процесса на всех этапах его формирования.

Традиционно выделяют три возможных пути проникновения и распространения бактерий по мочевой системе: восходящий, гематогенный и лимфогенный. Восходящий, или уриногенный, путь инфицирования органов мочевой системы считается доминирующим, так как уретра обычно контаминирована бактериями. Инфицированность ее возникает при катетеризации мочевого пузыря, дефектах гигиенического ухода. Размножаясь, бактерии проникают в верхние мочевые пути, достигая почки; этому способствует и наличие пузырно-мочеточникового рефлюкса. Наиболее частым этиологическим фактором здесь обнаруживается E. coli. Инфицирование органов мочевой системы представителями нормальной микрофлоры кишечника обусловлено колонизацией промежности (в том числе и препуциального мешка у мальчиков) выделяемыми из фекалий колиформами [13].

Гематогенный путь, т.е. занос бактерий в почки с током крови из инфекционных очагов, возможен при бактериальном эндокардите, центральном венозном катетере, тромбофлебитах. В этих случаях доминируют грамположительные штаммы микроорганизмов или грибы рода Candida, реже встречается грамотрицательная микрофлора [12, 13]. Наибольшие споры вызывает лимфогенный путь инфицирования. Если в середине XX в. распространение инфекции из кишечника признавали основным [8], то современные авторы считают лимфогенный путь малозначимым [6, 13].

Совершенно по-новому позволяют посмотреть на проблему ИМС данные, убедительно доказывающие связь инфекций мочевой системы у детей с внутриутробным инфицированием, а развитие пиелонефрита у беременных -- как следствие инфицирования органов мочевой системы у девочек [7, 12]. В связи с этим в настоящее время представляется более приемлемым рассматривать механизмы передачи инфекции не по Л.В. Громашевскому [1], а в трактовке Г.П. Ковалевой (1995), которая предложила выделять два механизма передачи инфекции: естественный и артифициальный [2]. При этом естественный тип подразделяется на три подтипа: горизонтальный (традиционный, по Л.В. Громашевскому), вертикальный (на разных этапах внутриутробного развития) и заражение во время родов -- промежуточный вариант между вертикальным и горизонтальным. Артифициальный тип, когда инфицирование происходит при выполнении медицинских манипуляций (эндоскопия, катетеризация, инъекции и т.п.), т.е. применительно к ИМС вариант формирования нозокомиальных (госпитальных) инфекций.

Цель исследования -- разработать экспериментальную модель для изучения патогенеза инфекций мочевой системы.

Материал и методы исследования

Экспериментальные исследования проводились в Центральной научно-исследовательской лаборатории (ЦНИЛ) Омской государственной медицинской академии (ОмГМА) (г. Омск) со строгим соблюдением требований Европейской конвенции (Страсбург, 1986) по содержанию, кормлению и уходу за подопытными животными, а также выводу их из эксперимента и последующей утилизации. Хирургические манипуляции осуществлялись под эфирным наркозом.

В эксперименте использовали два вида подопытных животных: 27 кроликов породы шиншилла в возрасте 3--4 мес с массой тела 1 740--2 290 г (1 993,1 243,2) и 49 белых лабораторных крыс-самцов из питомника ЦНИЛ ОмГМА с массой 180--220 г (195,4 27,3).

Обоснованием для выбора кроликов при проведении экспериментальных исследований послужили следующие аргументы:

1) высокая естественная чувствительность к инфекциям;

2) возможность получения достаточных объемов крови для одномоментного проведения иммунологических, биохимических и серологических исследований;

3) простота повторного прижизненного забора мочи катетером в достаточном количестве для микробиологических и других лабораторных исследований;

4) наличие кроличьих люминесцентных сывороток промышленного производства для идентификации E. coli в мазках-отпечатках внутренних органов животных;

5) необходимость проведения иммунизации животных для получения гипериммунной сыворотки к штамму E. coli, использованному при проведении экспериментальных исследований.

Целесообразность выбора второй группы животных -- белых лабораторных крыс -- была обусловлена следующими факторами:

1) высокая естественная устойчивость к инфекциям;

2) возможность выполнения острого эксперимента на значительном количестве животных.

В качестве тестовой культуры использовалась суточная взвесь гемолизирующей E. coli с колицинотипом Ca 38 с содержанием микробных тел (МТ) в количестве 5 · 109 в 1 мл, доза подбиралась эмпирическим путем и вводилась в пересчете на 1 кг массы тела. Пути введения взвеси E. coli повторяли входные ворота инфицирования, известные в клинической практике: внутривенный, трансуретральный (восходящий), транскапсулярный в паренхиму почек, энтеральный и интратрахеальный (у крыс).

Взвесь E. coli вводилась кроликам в мочевой пузырь трансуретрально, что потребовало дополнительных гарантий от проводниковой контаминации. Для этой цели была разработана оригинальная модель мочевого катетера [3], позволившая исключить инфицирование мочи животных микроорганизмами из окружающей среды, так как забор проводился в замкнутую систему (шприц). Кроме того, использование данного катетера предупреждало обсеменение животного и окружающей среды высоковирулентным штаммом кишечной палочки, взвесь которой использовалась в эксперименте.

Крысам культура кишечной палочки вливалась через стенку мочевого пузыря под визуальным контролем после предварительной лапаротомии. Распределение животных по группам и дозы инфекта E. coli представлены в табл. 1 и 2.

Особенности поставленных задач определили некоторые различия распределения лабораторных кроликов и крыс на группы и кратность инфицирования. Так, у кроликов проведен хронический эксперимент с повторным 5-кратным введением взвеси E. coli в мочевой пузырь через уретру (трансуретрально) с интервалом в 3 дня для изучения восходящей (уриногенной) инфекции. В исследованиях с внутрипузырным введением инфекта на лабораторных крысах была поставлена иная задача: определить особенности распространения E. coli из нижних мочевых путей с введением 2,5 мл на 1 кг массы тела взвеси кишечной палочки в мочевой пузырь после предварительной перевязки и пересечения мочеточников. Для этого сформировали сопоставимые по численности подгруппы животных: II-а -- бактериологические исследования материала выполнялись через 1 ч (6 животных), II-б -- через 3 ч (6 животных), II-в -- через 24 ч (7 животных).

Для воспроизведения гнойно-деструктивного пиелонефрита использовалась разработанная авторами настоящей статьи, затем модифицированная экспериментальная модель острого гнойного деструктивного (апостематозного) пиелонефрита [11]. Применение суточной взвеси E. coli позволило точно дозировать количество инфекта и сделать эксперимент управляемым. Большая численность этой группы животных в сравнении с другими объясняется тем, что наряду с описанными в данной публикации исследованиями отрабатывался метод оперативного лечения гнойно-деструктивного пиелонефрита, основанный на вмешательстве на капсуле почки без декапсуляции [10].

При энтеральном заражении лабораторных крыс были поставлены две задачи. Во-первых, оценить вирулентность использованного штамма при данных входных воротах, для чего выделялась подгруппа I-a (n = 5) --

Таблица 1 Распределение кроликов по группам и доза вводимой взвеси E. coli

Таблица 2 Распределение крыс по группам и доза вводимой взвеси E. coli

взвесь E. coli вводилась трехкратно с интервалом в 30 мин (острый эксперимент). Во-вторых, воссоздать синдром избыточной колонизации кишечника у животных (подгруппа I-б, n = 6), для чего проведено трехкратное инфицирование взвесью E. coli с перерывом в 3 дня в дозе 1 мл на 1 кг массы тела (хронический эксперимент). У кроликов выполнялся только хронический эксперимент с 6-кратным введением культуры кишечной палочки с промежутком в 3 дня.

Для обнаружения кишечной палочки в биологических жидкостях и внутренних органах использовали бактериологический посев на среду Эндо. После верификации возбудителя проводили биохимическую дифференциацию на многокомпонентной среде Клиглера, цитратной среде Симонса, кровяном агаре [4, 5]. Также на среду Эндо делали посев содержимого тонкого (из верхнего, среднего и нижнего отделов) и толстого отделов кишечника после предварительного 10-кратного разведения в стерильной воде.

С целью проведения бактериоскопичесих исследований с поверхностей срезов внутренних органов (почек, мочевого пузыря, мочеточников, печени, селезенки, легких, костного мозга, лимфатических узлов, слюнных и пузырьковидных желез) делали мазки-отпечатки на предметные стекла. Аналогично обследовали биологические жидкости (кровь, желчь, мочу), которые предварительно центрифугировали. Мазки фиксировали фламбированием. Окраску выполняли карболовым фуксином по методике Пфейффера. Для обнаружения кишечной палочки в гистологических срезах и отпечатках органов мочевой системы использовали реакцию иммунофлюоресценции (РИФ). Предметные стекла с материалом обрабатывались иммунной сывороткой с экспозицией 1 ч. После промывки наносили антиглобулиновую люминесцентную сыворотку с родамином (экспозиция 1 ч).

Патологоанатомический материал для изготовления тонких срезов фиксировали в жидкости Кульчицкого (100 частей 95%-го этилового спирта и 1 часть ледяной уксусной кислоты) и в 10%-м растворе нейтрального формалина. Для обнаружения кишечной палочки в депарафинированных и замороженных срезах проводили окраску карболовым фуксином по способу Циля--Нильсена без докрашивания и с докрашиванием метиленовым синим.

Количественную характеристику клеточного звена иммунитета определяли унифицированным методом подсчета лейкоцитов в счетной камере, морфологическим исследованием форменных элементов крови с дифференциальным подсчетом лейкоцитарной формулы. Поглотительную способность фагоцитов определяли по фагоцитарному числу и фагоцитарному индексу. У кроликов данный показатель установлен в пределах 20--36%. Активность кислородозависимого метаболизма нейтрофилов исследовали в тесте восстановления нитросинего тетразолия (НСТ-тест). Проводились спонтанный и стимулированный варианты теста. Специфические иммунные факторы защиты выявляли в реакции торможения миграции лейкоцитов. Прямую реакцию торможения миграции под слоем агарозы (Clausen) выполняли путем получения суспензии лейкоцитов, реакцией непрямой гемагглютинации, реакцией фотохемолюминесценции [9].

Результаты и обсуждение

Внутривенное введение подопытным кроликам взвеси E. coli Ca 38 сопровождалось развитием клиники тяжелой генерализованной инфекции: животные отказывались от приема пищи и воды, катастрофически быстро истощались, в первые 12 ч развивался паралич задних конечностей. Гибель наступала в течение первых суток. При вскрытии макроскопически определялись множественные гнойные поражения внутренних органов, в том числе и почек. При морфологических исследованиях были выявлены очаги гнойной деструкции в корковом и субкапсулярном пространстве (апостематозный пиелонефрит). При бактериологических, бактериоскопических исследованиях и при иммунолюминесценции было установлено массивное обсеменение почек и других внутренних органов кишечной палочкой, биологические свойства которой совпадали с тестовой культурой. Аналогичные результаты получены в исследованиях на лабораторных крысах. Отличие заключалось в том, что в первые сутки погибли 2 из 5 особей. Неуправляемый характер течения инфекционного процесса послужил основанием для ограничения эксперимента у кроликов на группе в количестве 3 животных. В то же время получен очень важный результат, свидетельствующий о высокой вирулентности взвеси E. coli Ca 38, использованной в экспериментальных исследованиях.