Автореферат: Изменение патогенности Klebsiella Pneumoniae при дисбиозе кишечника, вызванного бластоцистной инвазией

- отбор пациентов и включение их в исследование;

- выявление бластоцистной инвазии у гастроэнтерологических больных;

- оценка бактериального пейзажа кишечника пациентов в зависимости от наличия бластоцистной инвазии;

- характеристика вирулентности клебсиелл, выделенных у пациентов с заболеваниями желудочно-кишечного тракта при бластоцистозе;

- молекулярно-генетические исследования клинических изолятов к

Klebsiella pneumoniaе;

- статистическая обработка полученных данных.

В работе были использованы штаммы Klebsiella pneumoniaе (n=190), выделенные у 78,2% пациентов из 243 обследованных больных.

С целью культивирования кишечной микробиоты использовали специальные дифференциально-диагностические и элективные среды. Изучение микрофлоры кишечника у больных и лиц контрольной группы проводили согласно приказу Минздрава России от 09.06.2003 № 231 «Об утверждении отраслевого стандарта «Протокол ведения больных. Дисбактериоз кишечника.» (ОСТ 91500.11.0004-2003) на базе бактериологической лаборатории ГУЗ Ульяновская областная клиническая больница. При изучении микробного пейзажа толстого кишечника определяли частоту высеваемости отдельных видов и их количественные показатели в пересчете на 1г фекалий (Багрянцева О.В., 2002).

Культуры, выросшие на питательных средах, подвергали групповой (анаэробные, неспорообразующие бактерии), родовой (лактобациллы, бифидобактерии, энтерококки) и видовой идентификации (стафилококки, эшерихии). Таксономическую принадлежность изолированных бактерий оценивали на основании изучения роста бактерий в аэробных и анаэробных условиях, отношения к окраске по Граму, характера роста на селективных средах, биохимической и серологической идентификации. Адгезивную колонизирующую и цитотоксическую активность исследуемых штаммов изучали на перевиваемых клеточных линиях НЕр-2 (Gibb А.Р., 1993).

Для детекции генов, кодирующих факторы патогенности Klebsiella pneumoniae, применяли ПЦР со специфическими праймерами (Muhldorfer I., 1994; Tamaki Y., 2005). Тотальную ДНК для идентификации генов выделяли с использованием набора реагентов ООО «ИзоГен» (Москва), НПФ «Литех» (Москва).

Проводили выявление генетических детерминант синтеза Р-фимбрий (pap С), б-гемолизина (hly A) и термолабильных энтеротоксинов (elt LT-1, LT-2). Для этого использовали праймеры, указанные в таблице 1.

Таблица 1. Используемые праймеры и соответствующие температуры отжига

Наличие бластоцист выявляли путем микроскопии нативных или окрашенных препаратов, приготовленных из фекалий больных. Размеры бластоцист определяли при помощи окуляр-микрометра. Исследования по выделению и первичной идентификации бластоцист из биологического материала проводили на базе бактериологической лаборатории ГУЗ Ульяновский областной клинический кожно-венерологический диспансер. Культивирование простейших B. hominis проводили с использованием среды Suresh CEM.

Микрофотографии сделаны на базе лаборатории научных исследований экспериментальной и клинической морфологии медицинского факультета ГОУ ВПО «Ульяновский государственный университет» с использованием микроскопа «Биолам I» (х1000).

Все полученные данные подвергали математической обработке с определением коэффициента достоверности Стьюдента и проведением корреляционного анализа Спирмена. Статистическую обработку материала осуществляли с помощью пакета программ Statistica 8,0.

Результаты исследований. Из 243 обследованных у 153 больных (62,9%) были обнаружены B. hominis, в группе сравнения инвазированность составила 5,8%.

Среди выделенных из фекалий Blastocystis hominis встречались две формы - вакуолярная и гранулярная, имеющие значительные структурные отличия. Вакуолярные формы бластоцист были обнаружены у 136 (88,9%), гранулярные - у 11 (7,2%) инвазированных больных, у 6 пациентов (3,9%) встречались обе формы бластоцист.

Выявляемость бластоцист у больных язвенной болезнью желудка (ЯБЖ) составила 88,9%, язвенной болезнью двенадцатиперстной кишки (ЯБДК) - 81,2%, хроническим гастритом (ХГ) - 66,1%, хроническим холециститом (ХХ) - 50%, синдромом раздраженного кишечника (СРК) - 37,5%, неспецифическим язвенным колитом (НЯК) - 35,5%. Частота встречаемости бластоцист была наиболее высокой при язвенной болезни желудка и двенадцатиперстной кишки (рис.1).

Рис. 1. Инвазированность обследованных с различными заболеваниями органов пищеварительного тракта

Анализ инвазированности бластоцистами показал, что в стадии обострения заболевания бластоцисты выявлялись у 71,5±19,6% пациентов, в то время как в период ремиссии показатель снижался до 57,7±9,8% (p<0,05).

С целью аргументации этиологической значимости бластоцист в развитии патологического процесса изучена их вирулентность. Установлено, что 71,3±4,7% штаммов бластоцист, выделенных у больных во время обострения заболевания, обладали вирулентностью, в то время как в период ремиссии доля вирулентных штаммов уменьшалась до 42,5±3,4% (ч²=23,6; p<0,001). Уровень вирулентности в период обострения заболеваний варьировал от LD₅₀ /lg 3,1±0,4 до LD₅₀ /lg 5,6±0,6. В зависимости от величины этого показателя все вирулентные штаммы были разделены на 3 группы.

Наиболее часто у пациентов с заболеваниями ЖКТ обнаруживались бластоцисты 2-й группы (43,1%), их вирулентность составила LD₅₀/lg 4,6±0,5. У бластоцист 1-й группы (27,3%) показатель вирулентности был ниже - LD₅₀/lg 3,0±0,2, у простейших 3-й группы (29,6%) - LD₅₀/lg 5,4±0,1 (рис. 2).

Рис. 2. Соотношение клинических изолятов Blastocystis hominis с различной вирулентностью (LD₅₀/lg)

Проведенное изучение микробиоценоза кишечника у гастроэнтерологических больных выявило значительное уменьшение показателей плотности колонизации индигенной микробиоты на фоне увеличения условно-патогенной (табл. 2).

Таблица 2. Микрофлора толстого отдела кишечника в зависимости от наличия бластоцистной инвазии у гастроэнтерологических больных

Примечание: * - достоверность различий показателей с группой сравнения (p<0,05).

Указанные нарушения, характерные для дисбиоза, в наибольшей мере были выражены при заболеваниях, протекающих на фоне бластоцистной инвазии.

Полученные результаты свидетельствуют о наличии значительных изменений в составе микрофлоры кишечника у обследованных лиц при бластоцистной инвазии.

Установлены значительные изменения обсемененности кишечника такими условно-патогенными представителями семейства энтеробактерий, как клебсиеллы и протеи. У пациентов с язвенной болезнью желудка уровень контаминации клебсиеллами превышал аналогичный показатель в группе сравнения в 12,3 раза, у пациентов с язвенной болезнью двенадцатиперстной кишки - в 12,7 раза, что значительно превышало значения микробного числа для других бактерий (рис. 3).

Рис. 3. Изменения патогенной и условно-патогенной микрофлоры кишечника при ЯБЖ и ЯБДК на фоне бластоцистной инвазии

Из выделенных 190 штаммов Klebsiella pneumoniaе 119 (77,8%) получены у гастроэнтерологических больных с бластоцистной инвазией (1 группа) и 71 (78,9%) - у пациентов с таким же спектром заболеваний, но без бластоцитоза (2 группа). У всех клинических изолятов K. pneumoniae изучали морфологические и физиологические свойства.

Из всех выделенных K. pneumoniae 72 штамма (43,7%) 1-й группы и 13 штаммов (46,4%) 2-й группы обладали слабо выраженной адгезией. Они поражали 19,22,7% и 18,72,6% клеток НЕр-2 соответственно, при этом на плазмолемме одной клетки обнаруживалось по 1-2 адгезированной бактерии, адгезивное число составило 3,30,7% и 3,10,4% соответственно.

Умеренную адгезивную активность проявили 39 штаммов (32,8%) 1-й группы и 25 штаммов (35,2%) 2-й группы. Они поражали 27,84,7% и 26,32,6% монослоя соответственно, адгезивное число в этих группах составило 3,90,6% и 3,60,4%.

Высокой адгезивностью обладали 27 штаммов (22,6%) первой группы и 15 штаммов (21,1%) второй группы. Они поражали 44,31,3% и 40,11,3% клеток НЕр-2, на каждой клетке пласта культуры фиксировались по 3-5 бактерий (адгезивное число - 4,80,7% и 4,50,9% соответственно).

Гемолитической активностью обладали 52,8% изолята Klebsiella pneumoniae 1-й группы и 51,7% штаммов 2-й группы.

В ходе работы выявлено, что частота встречаемости вирулентных клебсиелл, выделенных у гастроэнтерологических больных без бластоцистной инвазии, была достоверно меньше, чем при бластоцистной инвазии. Из 119 штаммов клебсиелл первой группы только 96 (80,7%) вызывали положительную кератоконъюнктивальную пробу. Среди клинических изолятов 2-й группы кератоконъюнктивит у животных вызывали 37 штаммов (52,1%; р<0,05). Из 96 штаммов клебсиелл 1-й группы, вызывавших положительную кератоконъюнктивальную пробу, 37 изолятов (38,5%) были выделены в ассоциации с высоковирулентными штаммами Blastocystis hominis.

Одним из основных свойств Klebsiella pneumoniae, способствующих реализации их патогенных свойств, является устойчивость к действию антибактериальных препаратов.

Таблица 3. Чувствительность к антибиотикам штаммов Klebsiella pneumoniae, выделенных у гастроэнтерологических больных

Примечание: * - показатель достоверности между чувствительностью к антибиотикам клебсиелл, выделенных при бластоцистозе и без него.

Проведено определение чувствительности 190 штаммов Klebsiella pneumoniae к 10 антибиотикам. Результаты проведенных исследований показали, что частота встречаемости чувствительных изолятов к различным антибиотикам была неодинакова (табл. 3).

Известно, что изменение патогенности у бактерий реализуется на генетическом уровне через мутации и генетические рекомбинации. Используя набор праймеров, амплифицирующих фрагменты генов pap С, hly A, elt LT-1, LT-2, были протестированы фенотипически различные Klebsiella pneumoniaе: 119 штаммов, выделенных у гастроэнтерологических больных с бластоцистной инвазией, и 71 изолят, выделенный из консорциумов, где бластоцисты не являлись участниками микробного сообщества.

Выявление ампликонов проводили у клебсиелл, выделенных из ассоциаций с B. hominis различной степени вирулентности, а также после их совместного культивирования. В качестве контрольного использовали эталонный штамм K. pneumoniae, содержащий гены, детерминирующие синтез факторов патогенности. Культуры бактерий при сокультивировании с простейшими отбирали в период увеличения их численности и проявления цитопатогенного действия на клетки бластоцист.